2023-12-28
2023年12月26日本公司发布了一款单细胞新产品：smRNAPSN-seq，该产品为科研人员提供了一种高通量的微生物单细胞转录组分析工具，它将促进未来在鉴定新的细胞亚群、微生物表型异质性的分子机制(耐药性、刺激环境适应性、代谢产物产量差异等)、微生物演化及微生物与宿主相互作用等领域的研究。下面让我们来回顾一下直播内容。
smRNAPSN-seq实验流程简介
smRNAPSN-seq的实验流程如图1所示。首先使用甲醛溶液对微生物细胞进行固定，交联胞内的核酸和蛋白质，以防止mRNA衰解；然后对固定后的微生物细胞进行透化，以便进行rRNA的去除；接着进行胞内rRNA去除，通过细菌计数板确定处理后的细胞悬液浓度并稀释至合适浓度。使用10X平台将单个微生物细胞与胶珠等组分封装到液滴中并进行RT反应，给每个cDNA上添加分子标签。破油后对标记cDNA进行扩增，最后进行文库构建，上机测序。
图1 基于10X平台的smRNAPSN-seq的技术路线及实验整体流程
微生物单细胞测序数据分析流程及内容
目前smRNAPSN-seq分析流程与内容：首先需要对获得的原始数据进行数据质控、基因组比对、10X Barcode和UMI统计及生成表达矩阵等基本分析；之后对过滤后的数据进行细胞聚类及可视化等初步分析，在此基础上可进行菌群鉴定、基因功能注释及拟时序分析等高级分析(如图2所示)。为验证smRNAPSN-seq实验技术和分析流程的可行性，我们进行了内测实验，部分数据分析结果如图3所示，UMAP分析显示出17个细胞亚群，其次每个亚群间的高表达基因和基因表达量也出现明显差异(图3a、b、c)。同时确定每个亚群的差异表达基因并进行了热图分析(图3d)。此外，样本间的数据分析显示：空白组与处理组的细胞亚群比例和部分功能基因表达量存在显著差异(图3e、f)。以上结果表明细菌在处理的条件下会出现异质性，而传统的转录组测序会掩盖这种异质性的存在，而smRNAPSN-seq可以发现并区分这种异质性。
图2 smRNAPSN-seq生信分析流程
图3 smRNAPSN-seq内测数据结果展示
微生物单细胞测序项目主要优势
smRNAPSN-seq是本公司自主研发的基于10X平台的创新型微生物单细胞转录组测序技术，具有以下优势：
具有完善的质控体系(如图4a，b)，保证高质量数据产出(如图4c)；
具有较低的rRNA占比(如图4d)，保证具有较高的数据利用率；
基于10X微流控平台，具有稳定的微流体分隔体系；
具有实验流程和操作简单快捷，减少人为误差；
周期可控，更快的项目周期和更好的数据；
本公司具有完善的配套分析流程，从实验到分析一站式服务。
图4 微生物单细胞测序项目主要优势
微生物单细胞转录组测序的应用方向
本公司采用smRNAPSN-seq方法分析了在实验处理条件下菌群的异质性，大大增加了发现稀有罕见细胞亚群的概率，同时可以根据细胞亚群间的差异和高表达基因进行基因选择敲除，以此在单个细胞的层次来探究细胞耐药性和持久性等分子机制。此外微生物单细胞转录组测序还可应用于以下研究，如图5所示。这项技术的出现对生物技术、临床医学、农业微生物等领域具有深远的影响。在单个细胞的层次破译细菌细胞的基因表达谱，可以使得科研工作者们更加了解它们的进化起点，从而为相关实验的指导提供方向与指引。
图5 微生物单细胞转录组测序的应用方向
微生物单细胞转录组测序的未来展望
近年来，随着微生物单细胞转录组测序文献陆陆续续的发表，单个菌体或混合菌体的微生物单细胞转录组的研究方法已相当成熟，扩宽了当前微生物组学的相关研究，同时也开启了微生物组学测序新篇章，也显示了科研工作者们对于微生物组学研究的追求，对于微生物单细胞转录组测序技术有着更高的期望。因此环境样品的微生物单细胞转录组测序成为了下一个研究热点。而环境样品具有复杂的理化性质、丰富的微生物种类，对于实验样品的预处理存在巨大的考验，后期我们会进一步克服相关的难点，完善环境样品的微生物单细胞转录组测序技术，为微生物组学的发展提供更大的助力。
