2024-01-05
随着单细胞测序技术的快速发展，单细胞测序的应用范围越来越广泛，从动物、植物领域逐渐触及微生物领域，微生物包含细菌、真菌、病毒等生物，其中应用于原核生物的单细胞测序技术具有mRNA丰度低、转录本不稳定、拷贝数低、缺乏polyA尾等因素，除此之外原核细胞体积小，细胞外包裹有厚且复杂的细胞膜和细胞壁，较难裂解。而针对以上的部分技术难点，本公司具有完善的质控体系。
1、微生物细胞样品状态鉴定 寄送的微生物细胞样品需要对其样品状态(死活率、RNA状态等)进行鉴定。首先对样品中取出的一部分细胞悬液进行荧光染料染色，在荧光显微镜下观察，发出绿色荧光的细胞为活细胞(图1a)，发出红色荧光的细胞为死细胞(图1b)，使用软件工具将活细胞图和死细胞图合并在一起计算细胞活性(活细胞数量/总细胞数量的比值)(图1c)。其次需要对微生物细胞总RNA进行提取并检测(图2)，保证样品RNA具有较好的完整性(RIN > 8)。 图1 微生物细胞死活率质检图 图2 微生物细胞RNA 2100质检图 2、微生物细胞的固定 针对原核细胞转录本不稳定，半衰期短的特点，需要对微生物细胞进行固定，以此来锁定微生物细胞的瞬时状态，提高转录本的捕获效率。目前市场上常用的细胞固定试剂有甲醛、乙醛、甲醇、丙酮、福尔马林和氯醛酸，其中甲醇、乙醛、丙酮和氯醛酸的交联作用较弱，无法很好地将蛋白质与核酸紧密地交联，而甲醛和福尔马林具有较强的交联作用，但福尔马林主要用于组织固定且挥发性较强，因此甲醛固定微生物细胞是最佳的选择。甲醛可以与细胞内的蛋白质发生交联反应，固定细胞的结构和形态，便于微流控上机；可以与核酸中的碱基发生交联反应，防止核酸降解和流失。 3、微生物细胞透化效果检测 甲醛固定对于细胞膜而言，可以使得细胞膜上的蛋白质和脂质分子交联固定，从而保持细胞膜的完整性和稳定性；对于细胞壁而言，可以使得壁上的多糖和蛋白质交联固定，增加细胞壁的稳定性和硬度，并且不会对细菌的细胞壁和细胞膜造成物理损伤，因此固定后的微生物细胞需要进行透化处理以便后期进行rRNA去除和细胞裂解。细菌透化采用含有溶菌酶的试剂进行孵育处理，因微生物细胞的种类不同，其细胞膜和细胞壁的复杂程度也不一样，因此需要不同的透化参数与条件，而透化效果的好坏关系到rRNA去除和mRNA捕获的情况，只有构建相应的透化质控体系才能保证稳定的数据产出。透化效果的好坏主要取决于与rRNA结合的寡核苷酸序列是否可以顺利进入胞内进行rRNA消除反应，而我们采用带有绿色荧光的特异结合保守基因的寡核苷酸序列与透化菌体进行孵育杂交，根据荧光强度判断透化效果。以某一细菌为实验对象，对透化质控体系进行验证：首先是打孔试剂的打孔效果的鉴定，通过在荧光显微镜下观察未打孔与打孔样品的荧光强度来判定打孔的效果，如图3所示，左图为打孔镜检图，右图为未打孔镜检图。其次是溶菌酶试剂的不同孵育时间的效果鉴定，通过在荧光显微镜下观察样品的荧光强度来判断溶菌酶试剂不同孵育时间的处理效果，如图4所示，分别为溶菌酶试剂处理1min(左上)，5min(右上)，10min(左下)和15min(右下)的镜检图，其中溶菌酶试剂处理10min时荧光强度最强，透化效果最好。 图3 打孔效果镜检图 图4 溶菌酶试剂不同孵育时间的效果镜检图 不同的微生物样品，不同的细胞结构，采用本公司的质控体系对不同的微生物样品进行固定与透化参数的测试，从而不断地积累实验样品处理经验，为更多的科研工作者们提供更加完善、更加快速的技术服务。
