2024-01-08
1.细胞类型注释的时候，列表中展示的marker基因是什么？需要几个marker基因来确定一种细胞类型？marker基因只有列表中提供的这几种吗？
marker基因是在已知细胞类型中特异表达的基因，是用于定义该细胞类型的标记基因。
确定一种细胞类型的marker数量是不固定，取决于marker 基因的特异性和不同项目中的样本细胞基因表达情况。
一般来说，人和鼠等常见物种，marker基因的数量较多，根据项目的实际表达情况，我们一般提供3-4个用于注释细胞类型的marker基因。部分稀有物种，可参考的文献较少时，我们一般提供1-2个用于注释细胞类型的marker基因。
2.γδT与αβT有什么区别，怎么注释γδT？
我们常说的T细胞其实是指αβT，约占T淋巴细胞的95%，其表面的T细胞受体（TCRs）由α链和β链组成。而γδT（Gamma delta T cells，GDTCells）约占T淋巴细胞的5%，TCRs由γ链和δ链组成。大多数的γδT细胞的特点是CD4-/CD8-[1]。
在T细胞注释的时候，一般先根据CD3D,CD4,CD8A的表达，初步将T细胞划分成CD4T 和CD8T；随后查看是否有特殊T细胞的存在，比如γδT。γδT一般会表达CD3D，不表达CD4/CD8A；最后，再根据γδT特异表达的marker基因，如TRGC1,TRDV2等，来判断是否有γδT。
图一 αβT与其他T细胞的区分
3.肿瘤细胞是怎么注释的？
肿瘤细胞具有异质性，目前暂无特异的marker基因能将恶性细胞和正常细胞区分开来。我们提供的marker列表上所展示的基因，是肿瘤来源的细胞类型的marker基因或者是肿瘤特异性上调的差异基因，并不是鉴定肿瘤细胞的marker基因。
而在实体肿瘤项目的研究中，推荐使用单细胞拷贝数变异（CNV）分析来区分恶性细胞和正常细胞。目前主流的分析软件有inferCNV，inferCNV需要一组正常细胞作为参考，通过热图就能够看出肿瘤基因组中的哪些区域发生了扩增或缺失，从而帮助判断肿瘤细胞。
4.对于Unknown亚群，是不是就无法定义？
在定义细胞类型的时候，会遇到某个cluster不表达已知的marker基因，这种情况不代表这个cluster就无意义，因此会保留该cluster，并定义为Unknown。对于这类细胞，可以参考差异基因富集结果或根据细胞表达的基因功能来定义细胞类型。
巨噬细胞可以继续细分成M1,M2亚型吗？还有别的注释方式吗？
部分组织样本的巨噬细胞可以注释到M1,M2亚型，但这种注释方式，会使得巨噬细胞失去内部的异质性，不利于进一步的研究。
目前有文献采用机械分群的方式，同时选择每个cluster的差异基因列表中高表达的基因进行亚群注释[2]。根据cluster中表达的基因功能来定义巨噬细胞，这种方式，极大程度的体现了巨噬细胞内部差异，有利于研究巨噬细胞内部的异质性。
图二 文献中巨噬细胞的定义
参考文献
1.harlotte M. Mousset,Willemijn Hobo,Rob Woestenenk, Frank Preijers, Harry Dolstra,Anniek B. van der Waart.Comprehensive Phenotyping of T Cells Using Flow Cytometry.Cytometry A.2019 Jun;95(6):647-654.
2.Jingjing Qi,Hongxiang Sun,Yao Zhang,Zhengting Wang,Zhenzhen Xun,Ziyi Li,Xinyu Ding,Rujuan Bao,Liwen Hong,Wenqing Jia,Fei Fang,Hongzhi Liu,Lei Chen,Jie Zhong,Duowu Zou,Lianxin Liu,Leng Han,Florent Ginhoux,Yingbin Liu,Youqiong Ye,Bing Su.Single-cell and spatial analysis reveal interaction of FAP+ fibroblasts and SPP1+ macrophages in colorectal cancer.Nat Commun.2022 Apr 1;13(1):1742
