2024-01-18
单细胞测序的发展通过研究细胞间基因表达异质性，彻底改变了转录组学的研究。虽然这些技术已应用于各种真核生物物种，并揭示了有关细胞异质性的大量信息，但它们在原核生物中的应用仍处于起步阶段。与真核单细胞转录组测序相比，由于原核生物内在转录本(转录本不稳定，拷贝数低，mRNA缺乏poly-A尾)和外在细胞结构(具有厚且复杂的细胞壁和细胞膜，体积小)的特征，在原核生物中建立类似的实验流程面临一些挑战，因此建立多套质控体系(固定后RNA质检、死活率质检和透化效果质检等)克服实验挑战，以适应多样化的科研和临床工作的开展。开展微生物单细胞转录组研究时，需要制备单细胞悬液进行实验。实验样品质量是微生物单细胞转录组测序实验的关键因素之一，因此针对微生物细胞样品的制备，保存与运输的要求进行了整理，赶紧来看一下吧！
单细胞转录组测序与常规转录组测序的区别-Advances in Applied Microbiology,2023,Ju
01、实验样品制备与运输的一般流程
(1)提前与派森诺生物项目主管联系，咨询详细的实验样本要求，实验样本需要具有高质量转录组图谱或转录组数据库，同时具有非传染性和非致病性等特点才可接收，满足要求后填写并提交样本信息单；
(2)在对实验样品进行接种培养时，需要在生物安全柜或超净工作台上进行接种培养，实验中使用的培养基、培养瓶以及耗材等都是无菌的，从而避免或减少外部污染或外部信号干扰，此外在对实验样品进行特殊处理时也要在生物安全柜或超净工作台处理，尽量避免操作污染。后续实验如未进行特殊标注，统一在生物安全柜或超净工作台进行实验操作；
(3)对于常规的细菌培养样品，优先取位于生长曲线指数期(OD600=0.3-0.5)的甲醛固定样品进行送样(实验操作可参考附录)，需寄送2管1ml新鲜冷的0.1M Tris-Hcl-RI重悬的细胞样品；如未经过甲醛固定，则需要提供2管(20ml)培养好的菌液或划线平板，附带液体或固体培养基以及培养条件；
不同生长时期的微生物细胞rRNA占比-mBio,2023,Homberger C et al.
(4)对于特殊处理的细菌培养样品，需老师自行进行相关的特殊处理操作，为锁定特殊处理后的实验样品的初始转录本状态，可进行甲醛固定(实验操作可参考附录)，需寄送2管1ml新鲜冷的0.1M Tris-Hcl-RI重悬的细胞样品。另外特殊处理操作信息可填写在样品信息单的备注一栏中；
(5)建议自测样本的状态(核酸完整度/是否存在污染等)或干冰邮寄样本由本公司质检；
(6)使用封口膜将存放甲醛固定样品或培养好的菌液的离心管以及及划线平板封闭好，采用适当的运输条件进行运输(运输条件见下文“样本储存与运输原则”)；
(7)实验室接收样本，测定运输盒内温度及样本状态，拍照记录并登记相关信息；
(8)组织相关的实验样本质控实验。
02、实验样本制备注意事项
微生物细胞样本制备需要保证细胞内的mRNA未降解流失，锁定转录本状态，具体可参考以下几点建议：
(1)防止细胞样品结团：取出位于生长曲线指数期的细胞样品后立即进行低温离心，去除液体培养基、杂质和细胞碎片后立即使用新鲜冷的4%甲醛进行重悬，吹打混匀至无肉眼可见的沉淀，将携带有甲醛重悬微生物细胞样品的四维旋转混匀仪置于4℃冰箱内进行震荡过夜固定；
4℃冰箱内甲醛重悬细胞悬液震荡过夜固定
(2)防止细胞样品RNA降解：微生物单细胞测序样品制备操作全程需要在4℃下进行操作，另外细胞的重悬溶液中也要加入RNase抑制剂，防止细胞样品RNA降解；
(3)保存与运输温度：微生物单细胞测序的不同类型的细胞样品需要遵照合适的保存和运输温度进行邮寄，温度过高或导致细胞样品RNA降解，温度过低会给细胞结构带来破坏。样本接收时，实验室需要对运输盒进行温度测量并记录，不合格样本将反馈异常，停止实验。
03、样本储存与运输原则
1、样本储存
甲醛固定样本和常规菌液样本(含液体培养基)均采用冰袋邮寄，划线平板常温寄送即可，甲醛固定样本从样本制备到实验前应不超过48h，常规菌液或划线平板从样本制备到实验前应不超过120h。
2、样本运输原则
① 填写样本信息单，发送邮件并打印纸质版；
② 细胞样本保存离心管或塑料平板应使用油性记号笔填写样本编号、日期(图A)；
③ 将样本置于离心管，用封口膜封闭管口，装入自封袋中(图B)；
④ 样本外部用缓冲膜包裹，防止直接接触冰袋引发结冰(图C)；
⑤ 选择厚度不低于3cm的泡沫盒，底部先放入一部分冰袋(图D)；
⑥ 放入样本与打印的样本信息单(图E)；
⑦ 根据寄送距离与时间，选择合适大小的泡沫盒与不少于4块冰袋，密封运输；
备注：需提前准备好冰袋，避免冰袋从-80℃或-20℃冰箱拿出直接使用，否则会由于温度过低导致样本结冰，破坏细胞结构；运输时间大于24h，应不少于6块冰袋。
⑧选择尽可能快的运输方式，样本寄送后，告知公司实验室精确的寄送时间及快递信息，以备实验室提前准备相关的实验样本质控实验。
实验样本包装实例
以上就是有关微生物单细胞测序样品的制备、储存与运输要求，为保证实验的顺利进行，希望各位老师按照以上要求进行操作。感谢您阅读我们的微生物单细胞测序送样指南！如果您对微生物研究感兴趣，想要了解更多关于单细胞测序的信息，或者需要我们的专业团队为您提供支持和指导，请随时联系我们。让我们携手探索微生物世界的奥秘，为科学研究贡献一份力量！期待与您的合作，谢谢！
附录-细胞甲醛固定实验流程
(1)将培养至对数生长期的菌液样品在4℃，5500×g条件下离心10min；
(2)弃上清，将底部细菌重悬在5ml新鲜的冷4%甲醛溶液(1×PBS溶解)中，4℃震荡过夜16h；
(3)次日，将细胞在4℃条件下以5500×g离心10min。去除上清液，将细胞重新悬浮在1ml新鲜的冷PBS-RI(0.1U/ul)中，并转移到无酶1.5ml离心管中，在4℃，7000×g离心10min，去除上清液，将细胞重新悬浮在补充有0.1U/ul RNase抑制剂(终浓度)的1ml新鲜的冷0.1M Tris-Hcl-RI(pH7.5)中(每一重悬细菌细胞操作，至少吹打10次以上，无肉眼可见沉淀)。
(4)试剂配制：
①10ml的4%甲醛溶液：在15ml离心管中加入0.4ml的甲醛溶液，用9.6ml的1xPBS溶解；
②10ml的PBS-RI(0.1U/ul)溶液：在15ml离心管中加入1000U的RNase抑制剂，补充1xPBS溶液至10ml；
③10ml的0.1M Tris-Hcl-RI（0.1U/ul）溶液：在15ml离心管中加入1000U的RNA酶抑制剂和1ml 1M Tris-Hcl pH8，补无酶水至10ml。
