2017-05-17
目前，转录组测序（RNA-seq）是检测生物体内全部基因表达变化的通用方法，RNA-seq有三大优势：无需知道实验样本的基因组序列；RNA-seq结果中包含比传统定量更多的信息；RNA-seq覆盖的范围更广，更精确。RNA-seq已经在基础医学、临床研究和生命科学研究领域得到广泛应用，但是有一个问题一直困扰着研究人员，那就是RNA-seq与RT-PCR结果不能完全对应，是什么原因导致的呢？这些对应不上的基因有什么共同特点？
2017年5月，来自比利时根特大学的Celine系统的阐述了RNA-seq中non-concordant序列的存在情况及其特点，结果发表在Scientific reports上。研究者以MAQC-1人通用和大脑RNA为样本，使用RT-PCR对RNA-seq数据进行验证，通过对18080个蛋白编码基因的分析，发现non-concordant在不同的RNA-seq分析方法中均存在，RNA-seq和RT-PCR的相关性超过80%，但是约15.1%-19.4%的RNA-seq结果与RT-PCR对应不上，non-concordant序列中有1.6%-2.8%与RT-PCR结果完全相反。non-concordant序列的共同的特点是序列较短和外显子少，但与GC含量和同源基因的多少没有关系。造成这些序列non-concordant的原因有很多，包括原始数据的过滤、接头引物的选择和分析方法等有关。
本研究证实了RNA-seq中non-concordant的普遍存在并阐明了这些序列的特点。因此我们在分析转录组数据时不能不假思索的全盘接受或只看表达量的变化，也要关注序列的长度、组成和检测质量等信息。如果RNA-seq结果与RT-PCR结果不相符，那么我们可以分析序列的长度、功能和外显子的组成等信息，而不是直接否定转录组的数据，如果部分目标序列的表达量低或者序列较短，那么我们可以使用RT-PCR进行多次验证，并通过其它实验进行验证。
总之，转录组的解析是一个系统工作，需要RNA-seq数据分析、RT-PCR以及其它辅助实验的紧密结合，这样才能使我们的数据更加准确和具有说服力。
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原始文献：
Everaert C, Luypaert M, Maag J L V, et al. Benchmarking of RNA-sequencing analysis workflows using whole-transcriptome RT-qPCR expression data[J]. Scientific Reports, 2017, 7(1): 1559.
相关文献：
1. Christelle R, Watson M. Errors in RNA-Seq quantification affect genes of relevance to human disease[J]. Genome Biology, 2015, 16.
2. Teng M, Love M I, Davis C A, et al. A benchmark for RNA-seq quantification pipelines[J]. Genome biology, 2016, 17(1): 74.
