2024-01-25
在微生物研究领域，传统的下一代测序技术已经取得了巨大的突破，极大地促进了我们对人体微生物组的分类、功能及其宿主影响的理解，但在揭示微生物群落复杂性和功能多样性方面仍存在一些限制。而微生物单细胞测序技术的问世，正为我们带来了一种全新的解决方案。与传统的NGS测序相比，微生物单细胞测序技术可以突破细胞混合效应，实现对微生物群落中每个个体细胞的独立测序和分析，从单个细胞的层面了解微生物菌落的异质性(不同形态特征、生化特性和基因表达谱等)、微生物群落中不同细胞的功能、互作关系和遗传变异。
上海派森诺2023年正式发布了微生物单细胞转录组测序技术服务产品—smRNAPSN-seq，基于10X 微流控平台的微生物单细胞转录组测序技术，实现了微生物单细胞水平的转录组分析，它将促进未来在鉴定新的细胞亚群、微生物表型异质性的分子机制(耐药性、刺激环境适应性、代谢产物产量差异等)、微生物演化及微生物与宿主相互作用等领域的研究。有关微生物单细胞测序技术的整体实验流程、实验质控、rRNA去除以及送样攻略前面已经介绍完了，现在让我们来介绍一下微生物单细胞测序技术的数据分析流程、实测数据结果以及主要应用方向。
数据分析流程 微生物单细胞测序技术主要的分析流程(如图1所示)。首先需要对微生物单细胞文库的原始下机数据进行基本分析，依次为数据质控、参考基因组比对、Barcode和UMI的校正与计数以及根据Barcode和UMI的统计结果生成Feature-Barcode表达矩阵。然后根据单细胞基因表达矩阵和每个细胞的表达谱特征去除低质量的细胞。使用相关软件识别与解释单细胞原始的表达矩阵中异质性的来源，该步骤主要包括细胞与基因的质量控制，降维与细胞聚类，标记基因可视化与差异分析等。在完成标记基因鉴定和差异分析后对基因集进行通路分析(GO和KEGG)以及使用Monocle软件根据单细胞基因表达的相似性进行拟时序分析来说明细胞类群之间的关系。 图1 smRNAPSN-seq数据分析流程
实测数据结果 为验证smRNAPSN-seq实验技术和数据分析流程的可行性，我们进行了内测实验，部分数据分析结果如图2所示，UMAP分析显示出17个细胞亚群，其次每个亚群间的高表达基因和基因表达量也出现明显差异(图2a、b、c)。同时确定每个亚群的差异表达基因并进行了热图分析(图2d)。此外，样本间的数据分析显示：空白组与处理组的细胞亚群比例和部分功能基因表达量存在显著差异(图2e、f)。以上结果表明细菌在处理的条件下会出现异质性，而传统的转录组测序会掩盖这种异质性的存在，而smRNAPSN-seq可以发现并区分这种异质性。 图2 smRNAPSN-seq实测数据结果展示
主要应用方向 本公司采用smRNAPSN-seq实验方法分析了在实验处理条件下微生物菌群的异质性，大大增加了发现稀有罕见细胞亚群的概率，同时可以根据细胞亚群间的差异和高表达基因进行基因选择敲除，以此在单个细胞的层次来探究细胞代谢调控等通路的分子机制。此外微生物单细胞转录组测序还可应用于以下研究：(1)抗生素耐药分析：无需进行分离培养，从单个细胞层次的基因表达情况研究细菌的耐药机制；(2)微生物时序表达分析：鉴定外在特殊状态的细胞并确定它们分化发育过程，结合基因表达变化，实现单个细菌内表达量的检测来解析微生物时序表达；(3)微生物群落功能定位分析：可以在研究单个细菌基因表达的基础上，将每个细菌(物种)与其基因表达信息相关联，有助于了解微生物群落内的异质性，生态进化压力和进化过程等，如图3所示。 图3 微生物单细胞转录组测序的应用方向 在微生物学研究领域，微生物单细胞测序技术的应用已经成为了不可或缺的工具。然而，这项技术对数据处理和分析能力的要求也在不断提高着。作为一家国内知名的科技服务公司，我们一直致力于开发最先进的工具和流程，以帮助研究人员更好地理解微生物世界的复杂性和多样性。我们的微生物单细胞测序数据分析流程，不仅可以提供高效、准确的数据处理和分析结果，还可以为您提供个性化的解读和建议，帮助您深入探索微生物群落中的生物学信息。感谢您的耐心阅读，我们期待为您的研究提供更优质、更全面的支持。
