2024-02-02
单细胞转录组测序可以测定每个细胞中的RNA，实现了较高分辨率下察看基因表达，这对于揭示细胞异质性、细胞之间分化发育关系、细胞间通讯的研究是一把“利器”，单细胞技术在2013年被《Nature Methods》评为年度技术。
类器官（Organoids）指利用成体干细胞或多能干细胞进行体外三维（3D）培养而形成的具有一定空间结构的组织类似物, 能在结构和功能上模拟真实器官，该技术于2017年被《Nature Methods》评为年度技术。对于难操作、伦理不允许的真实器官，类器官作为新兴的动物模型，成为研究疾病进展、抗癌药物筛选、药物毒理检测、基因和细胞疗法的重要成员。
目前，越来越多的研究人员将单细胞转录组测序应用到类器官组织，在多个研究领域发表了多篇文献。接下来，小派为您介绍“类器官+单细胞转录组测序 ”在指导类器官培养、研究生长发育、探究病毒感染机制的详细发文思路，助力您的科研探索。
应用01、指导类器官的培养 文章题目： Single-cell transcriptomic analysis of corneal organoids during development[1] 单细胞转录组分析角膜类器官的发育 发表期刊：Stem Cell Reports 发表时间：2023.07 研究背景：角膜类器官是研究眼部疾病和潜在药物的重要模型，不仅可以增加我们对疾病进展的了解，也可以作为祖细胞和干细胞移植的来源，用于角膜缘干细胞缺乏症（Limbal stem cell deficiency disease, LSCD）或促进眼损伤后的再生。但对于不同培养阶段类器官的分化状态，以及这些类器官能否代表真实器官仍不清楚，阐明其中的分化过程并评估其与真实器官的相似度，对于指导培养更符合需求、更能代表人类真实器官的类器官至关重要。 类器官来源及种类： 由人类iPSC (Induced pluripotent stem cells )培养得到的角膜类器官 研究思路： 研究结果： 对培养1个月、2个月、3个月、4个月的类器官分别进行了单细胞转录组测序（图1A, B）。培养1个月的类器官中包含了大量多能干细胞和增殖细胞，并且该时期已经产生上皮细胞和基质细胞。在培养2个月的类器官中，多能干细胞显著减少，角质细胞和角膜内皮细胞出现。在培养3个月和4个月的类器官中，角膜缘上皮细胞分化增加（图1C）。将本次研究的单细胞数据集与胎儿、成人角膜组织进行比较，发现随着类器官培养时间的延长，类器官的转录谱与胎儿角膜相似性逐渐降低，而与成人角膜相似性增加。但是，培养4个月的类器官，低于40%比例的细胞能够与成人角膜组织匹配，表明培养4个月的类器官仍然不能最好的代表成熟的角膜组织，在此基础上，延长类器官生长可能更有利于模拟成人角膜疾病（图1D）。 图1 角膜类器官单细胞转录组测序
应用02、研究生长发育 文章名称： Modeling Human Thyroid Development by Fetal Tissue-Derived Organoid Culture[2] 胎儿组织来源的类器官模拟人甲状腺发育 发表期刊：Advanced Science 发表时间：2022.03 研究背景：正常的甲状腺功能对终身健康有着深远的影响，甲状腺激素的缺乏和过剩都会影响身体健康。截至到目前，聚焦甲状腺发育的研究较少。由于妊娠期胚胎的甲状腺激素主要来源于母体，对于近年来、发病率逐渐增加的青少年甲状腺疾病，医生难以确定这类疾病是否起源于胚胎发育缺陷。为了鉴定甲状腺疾病潜在的早期诊断标记和治疗方法，从单细胞水平了解人类甲状腺发育，揭示关键的发育事件和调控因子至关重要。 类器官来源及种类： 妊娠12周胎儿和（诱导产生的）成熟甲状腺类器官 研究思路： 研究结果： 为了理解胎儿甲状腺的细胞构成和异质性，研究人员取样妊娠12周（n=1）和16周（n=2）的人胎儿甲状腺组织，进行单细胞转录组测序，一共获得18354个高质量细胞，细胞中位基因数为2784。根据经典marker基因对细胞进行注释，共得到13种细胞类型，其中具有合成和分泌甲状腺激素功能的甲状腺滤泡细胞（Thyroid follicular cells ,TFCs）占比最高（图2A）。为了比较不同发育阶段的TFCs，将妊娠12周和16周的TFCs进行组间差异基因分析，发现16周TFCs上调基因富集到甲状腺激素合成通路、cAMP信号通路等（图2B）。进一步对三个样本中的TFCs进行亚群细分，发现cluster3细胞主要存在于16周样本组，代表了一类较为成熟的TFCs（图2C-D），差异基因、转录因子分析发现cAMP信号通路特异存在于cluster3亚群中（图2E-F），暗示该通路在胎儿甲状腺成熟过程中发挥重要的功能。 图2 胎儿甲状腺组织单细胞转录组测序 为了研究甲状腺发育过程中的重要生物学过程，研究人员取样12周胎儿甲状腺组织，建立胎儿甲状腺类器官（Human fetal thyroid organoid, hFTO）,评估了该类器官产生甲状腺滤泡、合成甲状腺激素的能力（详情见原文）。为了证实cAMP信号通路调控甲状腺发育这一推测，研究人员在类器官（hFTOs）培养基中添加cAMP信号通路激动剂（forskolin，腺苷酸环化酶激活剂），发现类器官产生了更大的、有功能性的甲状腺滤泡结构（图3A），将由forskolin处理产生的类器官称为人成熟类器官（Human matured thyroid organoids, hMTOs）。分别取样hFTOs和hMTOs两种类器官组织进行单细胞转录组测序，细胞分群共获得5个cluster（图3B），其中cluster 2高表达基因富集到甲状腺激素合成和cAMP信号通路。对TFCs（cluster1,2,3）进行拟时序分析，发现hFTOs-TFCs位于发育早期，hMTOs-TFCs位于发育终端，这一结果从单细胞水平证明cAMP信号诱导/调控胎儿甲状腺的发育。 图3 胎儿甲状腺类器官单细胞转录组测序
应用03、探究病毒感染机制 文章名称： Zika virus targets human trophoblast stem cells and prevents syncytialization in placental trophoblast organoids[3] 寨卡病毒靶向人滋养层干细胞、抑制合体滋养层的形成 发表期刊：Nature communications 发表时间：2023.09 研究背景：寨卡病毒是一种通过蚊虫进行传播的虫媒病毒，孕妇感染寨卡病毒后，可以在胎盘组织，羊水和胎儿大脑中检测到病毒的RNA和蛋白质，表明寨卡病毒能够通过胎盘进行母婴传播。胎盘是妊娠期间连接母体和胎儿的重要器官，负责胎儿营养物质和气体交换，同时也作为物理和免疫屏障保护胎儿免受外源病原体攻击。其中的胎盘滋养层细胞是行使胎盘功能的主要细胞类型，主要包括细胞滋养层细胞（CTB）及由CTB分化而来的合体滋养层（STB）和绒毛外滋养层细胞（EVT）。为了研究寨卡病毒的跨胎盘传播，研究者们已经建立了多种实验室细胞模型，表明胎盘滋养层的不同细胞类型对病毒的敏感度不同，而具体原因仍然不清楚。因此需要更加稳定、灵活的模型来探索寨卡病毒感染不同类型人滋养细胞的特点和机制，滋养细胞类器官是探索胎盘对病原体可及性的一个有价值的模型。 类器官来源及种类： 人胎盘滋养层干细胞（hTSCs）衍生的3D胎盘滋养层类器官 研究思路： 研究结果： 研究者从人囊胚组织分离滋养层干细胞（Human trophoblast stem cells, hTSCs)，该细胞具有CTB细胞特性，能够分化产生STB和EVT细胞。分别将三类细胞与寨卡病毒共培养，在不同培养时间点检测细胞内病毒含量，发现hTSCs是寨卡病毒的主要靶细胞，并随着hTSCs分化程度的增加，细胞对寨卡病毒的易感性降低。进一步分析介导病毒入侵基因在寨卡病毒侵染过程中的重要性，发现AXL 和TIM-1是介导病毒入侵的关键基因，它们在hTSCs中的表达量高于STB和EVT（图A-D）。研究人员进一步利用hTSCs建立了胎盘滋养层类器官（图E），从滋养层细胞基因表达、激素分泌和分化潜能等多维度评估了类器官对原代滋养层细胞的模拟能力。随后利用建立的类器官进行寨卡病毒感染实验，结果表明hTSC类器官支持寨卡病毒的感染和复制，并且观察到寨卡病毒感染破坏了hTSC类器官结构（图F）。 图4 人滋养层干细胞和类器官病毒侵染模型建立 为进一步阐明寨卡病毒感染对滋养层类器官发育的影响，研究人员对寨卡病毒感染前、后的滋养层类器官进行单细胞转录组测序，共鉴定到4大类细胞：hTSC，CTB，CTB_Fusion和STB，具体细分为11类（图5A-B）。轨迹分析证明滋养层类器官中的hTSC细胞能够分化产生CTB和STB，即具有模拟滋养层细胞合体化的能力（图5C）。分析滋养层祖细胞marker基因在感染前、后的表达变化，发现这些基因在感染组的hTSCs中表达下降，暗示病毒感染破坏hTSCs细胞干性（图5D）。CTB和CTB_Fusion细胞在感染前、后的组间差异基因分析发现CTB细胞下调基因富集到细胞周期信号通路（图5E），CTB_Fusion细胞的下调基因富集到Hippo信号通路（图5F），该通路与对于滋养层祖细胞的自我更新是至关重要的，这些结果暗示病毒会感染破坏CTB细胞的增殖能力。 图5 人滋养层类器官病毒感染前、后单细胞转录组测序
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参考文献： [1]Swarup A, Phansalkar R, Morri M, et al. Single-cell transcriptomic analysis of corneal organoids during development. Stem Cell Reports. 2023;18(12):2482-2497. [2]Liang J, Qian J, Yang L, et al. Modeling Human Thyroid Development by Fetal Tissue-Derived Organoid Culture. Adv Sci (Weinh). 2022;9(9):e2105568. [3]Wu H, Huang XY, Sun MX, et al. Zika virus targets human trophoblast stem cells and prevents syncytialization in placental trophoblast organoids. Nat Commun. 2023;14(1):5541. Published 2023 Sep 8.
