2024-02-06
近期，四川省农业科学院植保所在生物学领域《Biomolecules》发表新研究成果！本研究利用BSA-seq分析方法和基于SSR构建遗传图谱进行QTL定位分析方法，成功地在水稻品种IR77298-14-1-2::IRGC117374-1中鉴定出一个新的与抗稻曲病相关的候选区间，并预测了该区间的候选基因。这一发现为水稻抗稻曲病育种提供了重要的信息和指导。
本研究的BSA测序和分析由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
研究背景
稻曲病（RFS）是一种由稻曲病菌引起的水稻穗病，广泛分布于世界上所有水稻种植区，其中最严重的地区是亚洲的水稻种植区。目前，培育抗病品种是控制RFS疾病的最有效措施。然而，国内外关于水稻RFS抗性基因/QTL的信息有限。本研究结合BSA分析和SSR标记，在水稻品种IR77298-14-1-2::IRGC117374-1中鉴定出一个新的与RFS抗性相关的QTL（qRFS12.01），并在qRFS12.01区域预测到5个含NB-ARC域的疾病耐受蛋白，这对于水稻稻曲病的抗性育种具有重要意义。
研究材料与方法
1、实验材料
以抗病品种IR77298-14-1-2::IRGC117374-1（父本）和感病品种“9311”（母本）为杂交材料，获得F2分离群体
2、测序平台
Illumina NovaSeq
3、分析内容
BSA分析、基于SSR构建遗传连锁图谱、QTL分析、候选基因注释
研究结果
1. IR77298-14-1-2：：IRGC117374-1对U. virens的抗性遗传特征
以抗性品种IR77298-14-1-2::IRGC117374-1为父本，感病品种9311为母本进行杂交，利用U. virens鉴定亲本和子代的抗性。所有F1代植物均为易感（S）或高感（HS），未发现抗性植株，表明水稻控制RFS抗性基因是隐性遗传的。在F2代群体的201株水稻中，抗性（R）和感病（S）分离比接近1:2.1，这与单基因遗传分离的理论比例（1:3）不一致。结果表明，IR77298-14-1-2::IRGC117374-1对RFS的抗性受多个基因座控制。
图1 接种21天后亲本和F1代水稻稻曲病的症状
图2 在不同抗性水平下，F2群体中水稻植株的数量
2. BSA-Seq数据统计及变异检测
样本原始数据共包含258,279,848条reads，不同样本的高质量数据大小在49.35-79.45 Mb。GC含量和Q30分别为44.43％-44.90％和93.59％-94.05％。与日本晴进行比对，每个样本的比对率都在98.25％以上，覆盖率为90.84％-97.21％。在9311、IR77298-14-1-2::IRGC117374-1、R-pool 和S-pool 中分别检测到2,954,310、2,913,481、3,482,716和3,504,278个SNPs，462,940、454,802、542,475和543,968个indels。
表1 BSA-seq样本的测序数据统计
表2 每个样本的基因型统计（SNPs）
表3 每个样本的基因型统计（Indels）
3. BSA-Seq的关联分析
使用ED值分析法进行BSA性状定位分析，在12号染色体上共鉴定到3个相关区域，区间范围分别为0.57 Mb（10.58-11.15 Mb）、3.07 Mb（16.56-19.63 Mb）和2.21 Mb（21.49-23.70 Mb），分别包含26、109和125个基因。在6号染色体上鉴定到1个相关区域，范围在0.03-0.81 Mb（0.78 Mb），含有64个基因。在这些候选区间中共鉴定出324个候选基因。
表4 通过BSA-seq关联分析鉴定的抗性候选区间
4. 基于SSR标记的RFS抗性QTL鉴定
本研究利用871个SSR标记对抗性亲本IR77298-14-1-2:IRGC117374-1和感病亲本9311的DNA多态性进行检测，其中RM5341、RM28195、RM1158、RM1103、RM28472和RM1047在样本间具有多态。利用6个SSR标记分析F2群体的基因型并构建连锁图谱，根据抗RFS的表型，获得QTL定位区间（qRFS12.01），区间位于12号染色体上的18,152,114 bp-19,155,838 bp。qRFS12.01对RFS抗性的表型效应达到28.74%，表明与qRFS12.01连锁的SSR标记(RM5341和RM28195)可以作为水稻RFS抗性辅助选择育种的有效分子标记。
图3 与抗性相关SSR标记的扩增结果
图4 抗稻曲病连锁图谱的QTL分析
5. 候选基因的鉴定
BSA-seq和SSR标记定位的重叠区域被做为最终候选区间，候选区间位于12号染色体的18.152-19.156 Mb，该区域大小为1.004Mb，即SSR标记RM28195和RM5341(qRFS12.01)之间的区域，包含41个候选基因，有22个成功被注释，6个基因与RFS抗性密切相关。其中，LOC_Os12g30590、LOC_Os12g30760、LOC_Os12g31160、LOC_Os12g31200和LOC_Os12g31620编码抗病蛋白，分别是含有NB-ARC结构域 的RGA2、At4g10780、Pik-2-like、RGA4-like和RPM1，LOC_Os12g30570编码 STY13-like。
图5 候选基因的GO注释
表5 RFS抗性相关候选基因
6. 候选基因的表达量分析
采用RT-PCR方法检测抗病亲本IR77298-14-1-2：：IRGC117374-1和感病亲本9311中6个候选基因的表达量。分析鉴定出对U. virens感染有响应的六个候选基因，其中5个（LOC_Os12g30590、LOC_Os12g31200、LOC_Os12g30760、LOC_Os12g31160 和 LOC_Os12g31620）在接种U. virens的抗病亲本 IR77298-14-1-2::IRGC117374-1 中显著上调。结果表明，这5种基因与抗病性密切相关。
图6 候选基因的qRT-PCR分析
结 论
本研究结合BSA分析和SSR标记，在IR77298- 14-1-2::IRGC117374-1中鉴定了一个针对RFS抗性的新的QTL qRFS12.01，并预测了与抗性相关的候选基因。qRFS12.01连锁的SSR标记可用于抗RFS品种的标记辅助筛选。这些研究结果为克隆控制抗RFS基因位点和培育抗RFS的水稻品种提供了重要信息。
如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：genome_support@personalbio.cn，联系电话：021-80118168-8615）！
文章索引：Fu, R, Zhao, L, Chen, C, et al. Conjunctive Analysis of BSA-Seq and SSR Markers Unveil the Candidate Genes for Resistance to Rice False Smut. Biomolecules. 2024: 14: 79.
