2016-06-13
本期我们以鸭疫里默氏杆菌（Riemerellaanatipestifer）Yb2为材料，学习如何借助Miseq平台进行全基因组序列分析，鉴定毒力基因！该研究成果由中国科学院上海兽医研究所的于圣青团队在线发表在国际学术期刊《Applied and Environmental Microbiology》(IF:3.668)，其中测序和分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
研究背景
鸭疫里默氏杆菌是一种能够引起鸡、鸭、鹅等鸟类患流行性传染性浆膜炎的细菌，能够给养鸭业带来严重的经济损失。不同的血清型和菌株之间毒力变化很大，目前除了毒力因子VAPD，CAMP溶血素和外模蛋白的相关报道，其他关于鸭疫里默氏杆菌致病的分子基础知识报道很少。本研究通过Miseq平台完成了对鸭疫里默氏杆菌Yb2的全基因组序列分析，借助随机转座子诱变和体内筛选鉴定出49个毒力基因，该数据对未来鸭疫里默氏杆菌基础发病机制的研究提供遗传基础。
材料和方法
材料选取：
1、野生型鸭疫里默氏杆菌Yb2
2、雏鸭（来自上海庄行鸭场）进行转座子随机突变和减毒突变体的分离
测序平台：Illumina MiSeq平台
文库：PE400和MP8K
分析内容
1、Yb2基因的预测和注释
2、Yb2基因组的进化分析：SNP分析；共线性分析；同源性分析和系统发育树重构
3、突变基因的鉴定和生物信息学分析
研究结果
1、鸭疫里默氏杆菌Yb2基因组特征
菌株Yb2有一个单一环状的染色体，无证据证明质粒的存在，预测有一个CRISPR序列，有七个假基因，2021个开放阅读框（ORF），平均长度976bp。KEGG注释结果显示，1217个ORFs被分到30不同的代谢途径。
2、进化分析
对菌株DSM15868、RA-GD、RA-CH-1、RA-CH-2 和 Yb2 进行单核苷酸多态位点（SNP）、共线性和同源性分析发现RA-GD和Yb2的遗传距离近。
3、随机转座子诱变和减毒突变株的分离
通过Tn4351插入突变失活构建突变体库，利用动物体内筛选获得超过100倍衰减毒力的突变体，通过转座子插入失活鉴定出49个毒力基因。
4、突变基因编码蛋白的生物信息学分析
通过PSORTb预测得到49个毒力基因编码蛋白的亚细胞位置。其中，25个基因编码产物为细胞质蛋白，6个基因编码产物为细胞质膜蛋白，4个基因编码产物为外膜蛋白，剩下的14个基因编码产物的亚细胞定位尚不清楚。
结果展示图
图1. Yb2基因组注释和GC偏移
图2 鸭疫里默氏杆菌基因组序列示意图总结通过转座子随机突变、体内筛选完成了鸭疫里默氏杆菌YB2的全基因组序列分析，鉴定出49个毒力基因，该研究为后续细菌鸭疫里默氏杆菌感染的耐药性和持久性提供指导。
参考文献：
Wang X, Ding C, Wang S, et al. Whole-Genome Sequence Analysis and Genome-Wide Virulence Gene Identification of Riemerellaanatipestifer Strain Yb2. Applied and Environmental Microbiology, 2015, 81(15): 5093-5102.
