2018-06-21
最近，派森诺生物再次与山东大学合作，在《Bioresource Technology》（影响因子5.651）上发表文章，揭示厌氧氨氧化耦合反硝化（SAD）过程中，有机质和粉末活性炭如何分别驱动细菌菌群发生进化。
1 研究背景
近期，富氮废水受到了很多关注，因为它潜在威胁着水生生态系统。厌氧氨氧化被认为是一种去除废水中氮的方法。这一原理过程是厌氧氨氧化细菌利用亚硝酸盐作为电子受体，在无氧条件下直接将铵盐转化为氮气。问题就是厌氧氨氧化细菌生长速度缓慢，一般细菌倍增时间达到11天，而在膜生物反应器（MBR）中倍增时间缩短到了3天。虽然MBR有着明显的优势，但是对其采用什么样的控制方法和怎么减轻膜污染依然是个挑战。
在传统方法上，通过使用粉末活性炭减少膜表面上有机物和无机物的吸附来缓解膜污染。在SAD过程中，有机质（OM）可以做为电子供体消耗亚硝酸盐。尽管反硝化作用需要足够的OM，但是废水中有限的OM更有利于厌氧氨氧化，这可以避免受OM的抑制作用和外来碳源的高成本费用的限制。目前，SAD过程中活性炭粉末（PAC）对微生物菌群的影响还是不清楚的，所以有必要对SAD过程中OM和PAC对菌群进化的影响进行研究。
本文研究目的是揭示SAD过程中，OM和PAC能直接驱动反硝化作用的增强。主要目标：1、在OM含量，有或者没有PAC的条件下，对抗膜污染淹没式厌氧膜生物反应器（SAMBRs）中SAD过程进行启动和评估；2、研究OM和PAC驱动下SAMBRs中微生物菌群的变异；3、探究PAC对膜污染控制过程中的影响。
2 研究方法
测序技术：Illumina MiSeq平台
测序模式：16S rRNA基因V4区
实验设计：
3 研究结果
3.1 OM对厌氧氨氧化活性和EPS（胞外聚合物）含量的影响
在第12-30天，反应器B流出的铵盐和亚硝酸盐持续减少，反应器A表现出更好的除铵性能。在第30天，增加了铵盐和亚硝酸盐的流入，同时提高了反应器B中OM的含量。发现反应器A中硝酸盐的流出浓度呈增加趋势，说明获得了厌氧氨氧化活性。对于反应器B，铵盐和亚硝酸盐的流出显著增加，OM浓度在第33天有了显著的增加，结果说明厌氧氨氧化活性受到明显抑制，特别是提高了OM浓度之后，趋势更明显。而当减少OM的浓度时，减轻了对厌氧氨氧化的抑制，随后流出的铵盐和亚硝酸盐也缓慢减少。
刚开始的时候，两个反应器中种泥的总EPS含量是一样的，都是96.5 mg/g VSS。而驯化了30天后，两个反应器中的EPS含量分别是102.3和101.5 mg/g VSS。并在60天表现出来了差异性，反应器A和B的总量分别是115.3和95.8mg/g VSS。
图1反应器中去除率的统计分析
3.2 SAD过程中启动，运行和功能基因的定量分析
在第20天，RC有着更高的去除铵盐和亚硝酸盐的效率，硝酸盐产出也比RA和RB低。第20-68天，铵盐和亚硝酸盐的去除效率达到86%和88%，在第96-124天，所有反应器达到了稳定状态，而且很明显RA中亚硝酸盐的产出要高于其他两个反应器。
通过qPCR获得第10天和120天三个污泥样本中amoA，nxrA，Anammox 16S rRNA和nirS的丰度。明显可以看出Anammox 16S rRNA和nirS的拷贝数要比amoA及nxrA高，说明厌氧氨氧化和反硝化细菌在三个反应器的运行中占主导地位。在第10天的三个反应器中Anammox 16S rRNA和nirS有着几乎一样的基因拷贝数，但是110天之后，微生物菌群明显就不同了。RA中的厌氧氨氧化基因的拷贝数要比RB和RC高很多，而在RC中nirS基因的拷贝数要比RA和RB高很多。
表1 反应器运行过程中各性能数据统计
图2 第10天和120天反应器中功能基因拷贝数
3.3 三组污泥样本中微生物多样性和微生物菌群
从菌群的α多样性分析结果中可以看到RC中微生物多样性（Shannon和Simpson指数）略高些，在RA和RC中丰富度（OTU数，ACE和Chao1指数）比较低。说明OM和PAC的加入可能影响到了少数菌群的生长。
对三个反应器样本进行Metastats差异分析，在门和属水平上，发现RB和RC表现出相似的菌群，并且和RA有着明显的微生物菌群进化关系。同时通过韦恩图分析结果证明RB和RC有着更相似的微生物菌群。
表2 三个反应器中污泥样本的微生物丰富度和多样性评估
3.4三个反应器中微生物菌群结构和PAC对膜污染的影响
为了验证三组污泥样本的细菌菌群差异，在门和属水平上分析菌群的结构组成。分析发现三个反应器的样本在门水平上的优势物种是Planctomycetes，Proteobacteria，OD1和Bacterioidetes，百分占比之和超过了50%。而且发现Planctomycetes在RA中的相对丰度明显比RB和RC要高，OD1也是这样的现象。同时发现Proteobacteria在RB和RC中的相对丰度也是高于RA，而且Bacterioidetes的这种趋势更明显。从相对丰度高于0.5%且排名前9的属的丰度图中可以看出，Candidatus Brocadia和Kuenenia在RA中要明显高于RB和RC。而反硝化属中Bacillus、Paracoccus、Bacteroides和Thauera在RA中的相对丰度要比RB和RC明显低很多。
图3 反应器中门和属水平上微生物菌群结构图谱
基于KEGG的菌群功能预测分析表明，细胞运动性相关的功能基因随着OM的加入是有所减少的，而PAC的加入增强了这种减少趋势。而膜转运相关的功能基因，随着OM和PAC的加入得到了提高。还发现除了硝酸盐还原酶和固氮酶，几乎所有的反硝化代谢酶都随着OM和PAC的加入而有所增强。从基于COG数据库的分析结果中可以看出，挑选的17个鉴定到的基因中有14个是负责反硝化作用，4个是和厌氧氨氧化相关，1个是反硝化和厌氧氨氧化两者功用的基因。其中，除了和硝酸盐还原酶相关的基因外，负责反硝化作用的功能基因在RB和RC中的丰度是显著高于RA的。而且发现RB的膜在第65天和108天时被阻塞和清扫，同时RC组的膜在第85天被清扫。说明PAC的添加是可以控制SAD过程中膜污染的一个有效方法。
图4反硝化作用和厌氧氨氧化代谢酶的相对丰度
4 总结
在防污浸没式厌氧膜生物反应器中，发现厌氧氨氧化耦合反硝化（SAD）过程中有机质（OM）和粉末活性炭（PAC）驱动菌群发生了明显变化。qPCR和高通量测序结果表明OM在微生物菌群进化中有着关键性作用，推动反硝化菌群挑战厌氧氨氧化的优势主导地位。在SAD过程中添加PAC减轻了膜污染，同时刺激了反硝化细菌的丰度发生变化，导致优势门从Planctomycetes变为Proteobacteria。SAD过程中的功能预测结果说明在低COD/N值下，OM和PAC可以驱动反硝化作用。
参考文献
Ge C H, Sun N, Kang Q, et al. Bacterial community evolutions driven by organic matter and powder activated carbon in simultaneous anammox and denitrification (SAD) process[J]. Bioresour Technol, 2017, 251:13-21.
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0960852417321508
