2018-06-26
LncRNAs在心血管发育和心血管疾病的发生发展过程中起着重要的作用，参与了细胞增殖、肥大和凋亡等过程，与动脉粥样硬化、心肌梗死、心力衰竭等疾病密切相关。
目前尚未发现LncRNAs在扩张型心肌病（DCM）方面的研究报道。
近日，华中科技大学同济医学院附属同济医院李华萍老师所在课题组结合RNA-seq手段进行了DCM关联病证的lncRNA挖掘，以期寻找新的药物作用靶点，结果发表在Cardiovascular Research（IF=5.878）。
随着基因测序技术的应用，在心血管领域将有更多的特异性lncRNA被发现，其生理效应及病理机制将逐渐被揭示。
本期主角：RP11-544D21.2 and XLOC_014288
[症状描述]充血性心力衰竭为主，气短和水肿较常见
[疾病诊断]依据病史、临床表现及心电图等检查
[疾病原因]病毒感染、细胞免疫、家族遗传、特发性
[流行病学]以中年人居多，男多于女
本文研究思路概述
第一步：表达谱测序（实验组vs对照组有139个lncRNAs上调，174个lncRNAs下调）
第二步：qPCR验证（TOP40差异lncRNAs中筛选出8个表达趋势一致的lncRNAs）
第三步：假阳性筛查（通过不同数据库功能交叉验证，最终得到4个可信的lncRNAs）
第四步：RNA-seq（对目标lncRNAs进行siRNA干扰，阻断其表达，进行转录组测序）
Figure 1：实验方案设计
Part1 表达谱测序结果分析
样本分组：
Control：10例健康志愿者组织样本
Case：14例扩张型心肌病病人组织样本
Table 1：测序样本概况
对实验组和对照组表达谱数据进行挖掘，根据p<0.05且|log2foldchange|>1的差异基因筛选标准，得到139个上调lncRNAs，174个下调lncRNAs；为了寻找跟表型关联紧密的差异lncRNAs，我们又从中筛选出TOP20的上下调lncRNAs，作为后续验证、寻找关键lncRNA的候选对象。
经过NONCODE database数据库筛查，其中有10个被认为是心脏功能性相关的lncRNAs，随后对其进行qPCR验证，由Figure 2D可知，验证结果显示一致性良好。
Figure 2：LncRNA profile in heart from 10 control and 14 DCM patients.
Part2 RNA-seq测序结果分析
前期准备
经过多数据库交叉验证，最终从验证的差异lncRNAs中筛选得到可信的两个：RP11-544D21.2和XLOC_014288，并分别在六种组织器官中进行表达水平检测，选取U6 siRNA作为内参，由Figure 3AB可知，RP11-544D21.2和XLOC_014288在各器官中普遍都有表达。
进一步在人心肌成纤维细胞（HCF）、人心肌细胞（HCM）、人心脏微血管内皮细胞（HCMEC)中分别验证RP11-544D21.2和XLOC_014288的表达情况，qPCR内参分别为COL1A1、TNT 、CD31，二者依旧显现出宽泛的区域表达特征。
上述结果表明，RP11-544D21.2和XLOC_014288可能作为多功能性lncRNA在扩张型心肌病的病理过程中发挥作用。
Figure 3：Tissue and cell distribution of identified lncRNAs.Relative expression levels of lncRNAs in different tissues after normalization to U6.
正式实验（两种靶向lncRNA+三种细胞样本）
Control：未经lncRNA Smart Silence处理的细胞样本
Case：特异性lncRNA Smart Silencer分别处理后的细胞样本
人心肌成纤维细胞（HCF）+人心肌细胞（HCM）+人心脏微血管内皮细胞（HCMEC)
由于单独的siRNA无法实现lncRNA的有效阻断，本实验选取了由三种siRNAs和三种反义寡核苷酸组成的混合体作为lncRNA Smart Silencer实现目标lncRNA的表达阻断。
对干扰后的细胞样本进行RNA测序分析，并对每个样本中TOP10的pathway进行差异基因富集分析，由Figure 4可见，RP11-544D21.2和XLOC_014288在不同样本的不同代谢通路中发挥的功能也是多样的。
Figure 4：Pathway analysis of lncRNAs in different cell types.
为了进一步探究RP11-544D21.2和XLOC_014288的功能多效性作用机制，利用TRANSFAC database数据库进行了lncRNA转录调控因子的预测，并筛查得到一个跟DCM相关的转录因子TFIID， TFIID是II型RNA聚合酶复合物前体的一个组成单元，一般由TAFs家族因子组合而成。
对TAFs进行定量检测发现，相较于对照组，TAF10 和 TAF1C在DCM样本中表达量上调；TAF1L、TAF5和TAF11在DCM样本中表达量显著下调。
借由以上实验数据，可以窥见TFIID在充血性心力衰竭患者体内表达的不平衡性。相关性表达分析数据则表明，TAF10与四个DCM样本中上调表达的lncRNAs均呈现良好的正相关。后续的CHIP-PCR实验也证实TAF10与RP11-544D21.2有特异性结合位点。
Figure 5：Transcription factor for differently expressed lncRNAs.
结语
随着现代生物学技术尤其是高通量测序技术在治疗心血管疾病研究中的应用，心血管疾病药物证候相关的lncRNA标志物将被发现，lncRNA作为治疗心血管疾病新的作用靶点也将被揭示。对阐明中药治疗心血管疾病的分子机制及新药的开发将具有重要意义。
