2018-08-14
蔗糖是植物中运输的糖，很容易被昆虫吸收以满足生理代谢的需要。 BmSuc1是一种新型动物β-呋喃果糖苷酶（β-FFase，EC 3.2.1.26）编码基因，首先在家蚕Bombyx mori中克隆和鉴定。推测BmSuc1通过有效水解从桑叶中吸收的蔗糖在家蚕-桑椹酶适应系统中发挥重要作用，但尚未被证明。在本文中，作者提供了家蚕β-FFase的功能分析。研究发现蔗糖酶活性主要依赖于β-FFase而不是α-葡萄糖苷酶来水解蔗糖并产生葡萄糖和果糖用于家蚕的发育。使用针对BmSuc1的短发夹RNA（shRNA）介导的RNAi系统，发现幼虫中肠中蔗糖水解的能力显着降低，并观察到异常表型，例如体积较小，重量较轻和发育迟缓。脂肪体中糖原储存显着减少。这些结果表明BmSuc1在家蚕的糖代谢中作为必需的β-FFase。
RNA-seq材料：两组样本，WT和RNAi-BmSuc1
测序平台：Illumina
1．BmSuc1的表达谱
为了确定BmSuc1的阶段和组织特异性表达谱，通过RT-PCR和qRT-PCR研究了家蚕各阶段不同组织中的mRNA水平。BmSuc1在整个幼虫发育过程中表达，并且在5龄幼虫中观察到最大表达（图1A和B）。在组织中，BmSuc1在中肠和丝腺的前部和中部表达。在其他组织中未检测到BmSuc1 mRNA，包括脂肪体，头部和马氏小管（图1C和D）。 这些结果与先前报道的一致，表明BmSuc1可能具有幼虫消化和丝腺发育的功能。
图1 BmSuc1在家蚕中的表达
2．BmSUC1在蔗糖水解中的基本功能
蔗糖及其他糖的酶活性检测结果表明，家蚕β-FFase（即BmSuc1）具有水解和转葡萄糖基化活性，且家蚕中蔗糖的水解主要取决于β-FFase的活性而不依赖于α-葡萄糖苷酶，而BmSuc1显示出典型的β-FFase特征。
3．shRNA介导的BmSuc1 RNAi
实验构建了五个BmSuc1-PXL-U6-shRNA重组质粒并转染BmN细胞系以评估每种shRNA的效率。siRNA2抑制BmSuc1的转录53％和蔗糖水解活性34％，因此被用于进一步分析。通过红色荧光的存在鉴定G1代中的阳性转基因卵（图2A）。此外，DsRed2在整个幼体（图2B）和幼虫脂肪体（图2C），中肠（图2D），前部丝腺（图2E）和中部丝腺（图2F）中表达强烈。选择两个独立的转基因家蚕品系，qRT-PCR和蛋白质印迹分析的结果表明，在转基因家蚕幼虫中，BmSuc1的表达在转录水平上和蛋白质水平上显着下调（图3）。
图2用红色荧光标记筛选RNAi - BmSuc1转基因家蚕
图3 qRT-PCR和western blot检测转基因家蚕中BmSuc1的沉默效果
4. RNAi-BmSuc1转基因系中的异常表型
通过记录所有龄期的幼虫体重，发现三龄幼虫的发育率存在明显差异；表达RNAi-BmSuc1的转基因个体的重量显着低于WT（图4A）。与WT相比，RNAi-BmSuc1幼虫的体尺一般也较小（图4B）。BmSuc1的敲除通过减小体重对家蚕幼虫的发育产生负面影响，其主要原因可能与减少脂肪体量有关。
图4 BmSuc1敲除后幼虫发育及异常表型
5. BmSuc1敲低后糖代谢的变化
为了表征BmSuc1敲低对家蚕幼虫糖分布的影响，作者分析了幼虫中肠(A)、血淋巴(B)、脂肪体(C)中主要二糖酶活性的变化（图5）。
图5 BmSuc1敲除后幼虫中肠(A)、血淋巴(B)、脂肪体(C)糖代谢变异模式
6. 转录组分析和糖代谢相关基因的转录分析
为获得关于家蚕总体糖代谢调节的更多信息，在第3天第5龄 RNAi-BmSuc1转基因系和WT幼虫中进行了中肠的转录组分析。总共在RNAi-BmSuc1系中发现了202个差异基因，包括162个上调基因和40个下调基因。通过GO分类和通过KEGG分析的DEGs作图的初步分析显示，大量的GO术语与糖代谢强烈相关，例如葡萄糖，己糖和碳水化合物代谢（图6）。这些结果表明，BmSuc1沉默导致中肠中糖代谢相关术语和基因的大规模改变。
图6 与糖代谢相关的GO分析
参考文献：
Q Gan et al. Biochim Biophys Acta (2018)
BmSUC1 Is Essential for Glycometabolism Modulation in the Silkworm, Bombyx Mori.
影响因子：5.108
转录调控事业部 王慧敏
2018年8月14日
