2018-09-13
正文
最近，派森诺生物与南京农业大学合作，在《Soil Biology & Biochemistry》（影响因子4.926）再次发表论文，利用高通量测序技术，研究不同施肥方法处理35年后，土壤中氨氧化菌群的群落结构与功能变化，揭示AOA、AOB对硝化作用的相对贡献度，探究影响氨氧化菌组成、丰度、多样性与活性的主要环境驱动因子。
研究背景
硝化作用是氮循环中至关重要的有氧环节，不仅影响着陆生生态系统中N的命运，还会促进土壤中一氧化二氮的释出与硝酸盐的淋溶。硝化作用中关键的一步——氨氧化反应，便主要由氨氧化古菌（AOA）与氨氧化细菌（AOB）介导。
在目前的农业生产中，人们经常施肥以改善植物营养状况，实现高产，但这同时也对土壤环境产生了强烈影响。目前的研究显示，AOA与AOB的群落结构主要受土壤pH和氨/铵比影响，而土壤中氨氧化菌群落的活性、丰度、多样性和组成，则会受到土壤盐分、有机碳、碳/氮比、温度和土壤质地的影响。这些研究让我们对氨氧化过程和氨氧化菌对环境变化的响应过程有了更多了解，但是，在自然环境，尤其是受到人为干扰的环境中，这些土壤因子对氨氧化菌群落的影响程度还不清楚，AOA与AOB对土壤硝化作用的相对贡献度问题也仍未得出结论。
氨氧化菌对生态系统非常重要，研究长期的不同施肥策略对氨氧化菌的活性、丰度、多样性和组成的影响，探究能驱动AOA与AOB生态功能的环境因子，对改善农业用地中硝酸盐的管理策略具有重要意义。
研究目的
2. 探究影响氨氧化菌群结构的主要环境驱动因子。
研究方法
测序技术：罗氏454焦磷酸测序平台
测序模式：AOA、AOB功能基因（amoA基因）测序
实验对象：不同施肥策略处理35年后的土壤样品
实验设计：于1981年选定实验地点，测定土壤中的理化性质，随后在该实验地点随机选取20个30 m2大小的样地，按照表1所示的五种处理方式开展实验，2016年3月，在每个样地中选取6个取样点，于0~20 cm深处取样后，将6个样点的样品混匀作为该样地的样品。采集的样品，一部分用于微生物测序，一部分用于测定土壤中的理化性质，同时设计1-Octyne（1-辛炔）实验区分AOA与AOB的氨氧化活动。
表1 不同样地的处理方式
处理方式 | 重复数 | |
Control | 不施肥 | 4 |
NPK | 只施NPK化肥 | 4 |
O | 只施有机肥 | 4 |
NPKO | NPK化肥与有机肥都施 | 4 |
HNPKO | 施高浓度的NPK化肥与有机肥 | 4 |
研究结果
1. 硝化势
不同施肥策略处理后的土壤硝化势显著不同，其中，只施有机肥的土壤具有最高硝化势（44.49 mg N kg-1 soil d-1），而只施NPK肥的土壤，硝化势最低（20 mg N kg-1 soil d-1）。不过，相较于对照组，O组与NPKP组土壤的硝化势分别增加了359.51%与140.25%，而NPK组与HNPKO组却分别减少了71.01%和35.51%。
图1 不同施肥策略下土壤的硝化势变化
2. AOA与AOB中amoA基因的丰度
①每克干土壤样品中，AOA中的amoA序列数为1.07×107~2.78×107拷贝数，AOB中的amoA序列数为5.67×105~2.72×107拷贝数；同时，AOA/AOB的amoA序列数比率在对照组中最高（46.67），O组最低（1.03），相较于对照组，AOA的丰度在NPK组和HNPKO组的土壤中显著减少了52.89~61.40%，而在O组与NPKO组中，AOA的丰度显著增高了6.72~16.77%；而土壤中AOB的amoA基因丰度，却在所有的施肥策略下都显著增加；
②AOA与AOB中amoA的序列数都和总的土壤硝化势呈正相关；
图2 不同施肥策略下AOA与AOB amoA基因的序列数
③辛炔敏感型的硝化势，指数式（exponentially）依赖于AOB的amoA基因序列数，而耐辛炔的硝化势却和AOA的amoA基因序列数呈显著的线性相关。
图3 耐辛炔（AOA）、辛炔敏感型（AOB）的硝化势指数与对应amoA基因序列数的关系
3. AOA与AOB的群落组成与多样性
①测序结果显示，土壤中AOA的物种多样性要高于AOB，同时，不同施肥策略下，土壤中AOA和AOB的群落多样性都出现了显著差异。这主要表现在，AOA的Shannon指数在对照组中最低，在NPKO组与HNPKO组中最高，而AOB的Shannon多样性指数在O组中最高，在其它四个组之间却没有出现显著差异；
②基于Bray-Curtis距离对土壤中的AOA与AOB群落进行PCoA分析后发现，不同施肥策略的土壤中存在的AOA或AOB群落之间出现了分离的现象，其中，NPK组土壤中的AOA群落与其它组的AOA群落明显分离，而NPKO与HNPKO两组的AOA群落聚集在了一起，对照组也和O组聚集在了一起。AOB群落则主要分为了三部分，NPK、NPKO和HNPKO组的AOB群落聚在一起，与对照组和O组区别开来。
图4 土壤中AOA、AOB群落的PCoA分析
③基于优势AOA、AOB中amoA OTU的进化树显示，AOA中的优势amoA OTU，主要属于group I.1b lineage（Nitrososphaera），这类OTU也在对照组和O组中占优势地位，也有部分OTU属于group I.1a（Nitrosopumilus cluster）和group I.1a-associated lineage （Nitrosotalea cluster），其中，group I.1a的OTU主要出现在NPKO和HNPKO组的土壤中；
图5 AOA amoA OTU的进化树（A）与不同施肥策略下各AOA 类群的相对丰度（B）
AOB的优势amoA OTU几乎归属于Nitrosospira-like属，并主要聚成了四类，即Nitrosospira cluster 8b、cluster 3a.2、cluster 3a.1和cluster 3b。
图6 AOB amoA OTU的进化树（A）与不同施肥策略下各AOA类群的相对丰度（B）
4. 环境因素对氨氧化菌的活性、丰度、多样性和组成的影响
ABT模型（aggregated boosted tree）显示，影响AOA活性与多样性的主要因素是土壤中的铵态氮（NH4+）含量，土壤pH不仅是影响AOA丰度与组成的主要因素，还能强烈影响AOB的硝化势与多样性；土壤电导率与铵态氮（NH4+）含量则分别影响了AOB的丰度与组成。
图7 各种环境因子对氨氧化菌活性、丰度、多样性和组成的影响
总结
本文通过研究不同施肥策略处理35年后的土壤中氨氧化菌的群落组成，结合土壤中的理化性质，探究不同施肥策略下氨氧化菌的群落结构与功能变化，以及影响氨氧化菌群结构的主要环境驱动因子，并得到以下结论：①只施有机肥的土壤硝化活性最高，只施NPK肥的土壤硝化活性最低；②AOA主导了对照组土壤中的硝化作用，AOB则主导所有有机改良土壤中的硝化作用，而施NPK肥的土壤中AOA与AOB的贡献率相差不大；③相较于对照组土壤，AOA的丰度在含低浓度NPK肥的有机肥中增加了，但在只有NPK肥的土壤中减少了，而AOB的丰度在所有施肥的土壤中都有显著增加；④不同施肥策略处理的土壤中氨氧化菌的群落组成有差异；⑤土壤中NH4+的含量是影响AOA活性、多样性，AOB组成的主要环境因子，土壤pH是影响AOA组成、丰度，AOB活性、多样性的主要环境因子，而AOB的相对丰度则主要受土壤电导率影响。
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Guo J, Ling N, Chen H, et al. Distinct drivers of activity, abundance, diversity and composition of ammonia-oxidizers: evidence from a long-term field experiment[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2017, 115: 403-414.
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S003807171630520X
