2018-10-11
正文
最近，派森诺生物与华中农业大学合作，在土壤学期刊《Soil Biology & Biochemistry》（影响因子4.926）再次发表论文，利用高通量测序技术，研究不同施肥方法处理26年后，土壤中亚硝酸盐氧化细菌（NOB）的群落结构变化，探究长期的施肥活动，对硝化螺菌与硝化杆菌类NOB群落的生态影响。
研究背景
硝化作用是氮循环中至关重要的环节，亚硝酸盐氧化细菌（NOB）是硝化作用第二阶段的关键菌群，它们广泛分布在α-、β-、γ-，和 δ-变形菌门与硝化螺菌中。
由于亚硝酸盐通常不会在环境中有所积累，由氨氧化古菌（AOA）与氨氧化细菌（AOB）介导的氨氧化反应通常被认为是硝化作用的限速步骤，事实上，由NOB介导的亚硝酸氧化作用在受到干扰的土壤系统中也能成为硝化作用的限速步骤。
近年来，许多研究都聚焦于土壤环境中AOA与AOB的生态功能上，而农业生态系统中，NOB对环境干扰（如农业土壤中不同的施肥方法）的生态学响应，NOB菌群和农业土壤中亚硝酸氧化反应活动的联系，以及NOB群落对土壤pH改变的响应仍知之甚少，亟待解决。
研究目的
1. 研究不同施肥方法处理26年后，各土壤中硝化螺菌与硝化杆菌类NOB菌群的丰度、多样性和群落组成；
2. 研究长期的施肥活动对硝化螺菌与硝化杆菌类NOB群落的生态影响。
研究方法
测序技术：Illumina MiSeq PE300
测序模式：nxrA、nxrB功能基因测序
实验对象：不同施肥方法处理26年后的土壤样品
实验设计：于1990年建立长期的施肥实验，实验地点的种植方式为：冬小麦（Triticum aestivum L.）-夏玉米（Zea mays L.）。在实验地点中，一共设有如表1所示的四种施肥方式，其中，NPK组的土壤有严重酸化现象。2016年11月，在每个样地中选取6个取样点，于0~20 cm深处取样后，将6个样点的样品混匀作为该样地的样品。采集的样品，一部分用于微生物测序与qPCR实验，一部分用于测定土壤中的理化性质。
表1 施肥方式
研究结果
1. 土壤理化性质
不同施肥方式处理26年后，土壤的理化性质如表2所示，不同处理后的土壤pH值存在显著差异，CK组与M组中的pH值要高于其它组，NPK组的pH值（4.83）最低。同时，所有处理组的TC、TN和SOC含量也具有显著差异，其中，M组中TC、TN和SOC的含量最高，而CK组中NO3-的含量在所有组中最低。不过，土壤中氨的含量在不同的施肥处理下仍相差不大。
表2 土壤理化性质
2. 土壤中的潜在亚硝酸盐氧化活性（PNO）
土壤的PNO值在0.07 ~ 0.37 μg NO2−-N kg−1 dry soil h−1之间。相较于不施肥的CK组，施肥各组中的PNO值都有显著增高。ANOVA分析也显示，土壤中的PNO值受到了施肥处理的显著影响（P<0.01），同时，PNO与土壤NO3−、TC 、TN和SOC之间都呈正相关。
图1 各种施肥处理的土壤中的PNO值
3. 硝化杆菌和硝化螺菌类NOB的丰度
通过nxrA、nxrB基因的拷贝数衡量了硝化杆菌与硝化螺菌的丰度，结果显示，硝化杆菌的丰度在MNPK组中最高，而硝化螺菌的丰度在CK组中最高，且显著高于各施肥处理组。同时，nxrB/nxrA基因拷贝数的比率在7.6 ~ 168.2之间，其中，比率最高的是CK组，其次是NPK、MNPK和M组，这表明，施肥处理对nxrB/nxrA基因拷贝数的比率有显著的消极影响。另外，除了NPK以外的其它组中，PNO与硝化杆菌的nxrA拷贝数都有很高的正相关性，与硝化螺菌的nxrB拷贝数却没有相关性，不过，PNO与nxrB/nxrA丰度的比例却有着很强的负相关性。
图2 不同施肥处理下，NOB的丰度
4.硝化杆菌与硝化螺菌类NOB的群落结构
利用高通量测序技术，实验共得到了678,665条高质量nxrA序列（2878 OTU）与370,887条高质量nxrB序列（3243个OTU）。在菌群多样性上，硝化杆菌类NOB的ACE与Chao1指数在每种处理间没有显著差异，但M组中的Shannon与Simpson指数要明显高于其它组；硝化螺菌类NOB的Shannon与Simpson多样性指数则是在MNPK和M组中最高，其次是CK与NPK组。
Anosim分析显示，施肥方法是能显著影响NOB群落的驱动因子，且在NMDS分析中，每种施肥处理下的硝化杆菌和硝化螺菌类NOB的菌群都各自聚在一起，与其它不同施肥处理的样品分离开来，其中，NPK组的硝化杆菌与硝化螺菌类NOB与其它各组之间差异最大。
图3 不同施肥处理土壤中，NOB菌群的NMDS分析
5. NOB群落组成与环境变化之间的关系
RDA分析显示，在所有的环境因素中，土壤pH值是影响硝化杆菌与硝化螺菌类NOB群落组成的最主要因素，同时，土壤SOC与TN含量也分别能在较大程度上影响硝化杆菌与硝化螺菌类NOB的群落组成。
图4 NOB菌群与环境因素相关性的RDA冗余分析
MRT分析显示，土壤pH值是NOB相对OTU丰度的强预测因子，硝化杆菌与硝化螺菌类NOB群落中，低pH水平的样品（NPK组）聚在了一起，与高pH水平的样品分离开来。同时，基于MRT分析结果的一般线性模型表明，在低pH值下，有四个硝化杆菌OTU与1个硝化螺菌OTU的丰度有显著增加，但也有7个硝化杆菌OTU与10个硝化螺菌OTU的丰度有显著降低，还有一个硝化螺菌OTU没有受到pH值的显著影响。
图5 不同施肥处理下，主要OTU（相对丰度>1%）的相对丰度与土壤性质的MRT分析，以及主要OTU的相对丰度对土壤pH值的响应
6. NOB的丰度、多样性和组成在预测PNO上的重要度
自动线性模型分析显示，nxrB/nxrA的丰度比率是PNO的最佳预测指标，解释率高达69%，而nxrB和nxrA的丰度，分别只有23%与8%的解释率。这表明，土壤中PNO的改变是通过硝化螺菌/硝化杆菌的丰度比率介导的。同时，硝化杆菌的Chao1和ACE指数也展现出对PNO的强烈影响，其次是硝化螺菌的ACE指数与硝化杆菌的Shannon指数。在NOB的群落结构方面，硝化杆菌是预测PNO最重要的指标，而硝化螺菌对PNO的预测作用则相对较弱。
图6 自动线性模型分析下，NOB的丰度、多样性和组成在预测PNO上的重要度
总结
本文利用高通量测序技术，结合qPCR技术与土壤理化性质检测技术，研究了不同施肥方式处理26年后的土壤中亚硝酸盐氧化细菌（NOB）的群落结构变化，探究了长期的施肥活动，对硝化螺菌与硝化杆菌类NOB群落的生态影响，并得到以下结果：①硝化杆菌的丰度在M、MNPK组中显著增加，而硝化螺菌的丰度在M、NPK组中显著减少，在MNPK中的含量也非常少；②硝化杆菌的多样性在M组中增加，硝化螺菌的多样性在M与MNPK组中均有增加，但在NPK组中减少了；③NMDS分析显示，硝化螺菌与硝化杆菌群落在四种施肥处理下均发生了转变；④冗余分析显示：pH+SOC和pH+TN显著解释了硝化杆菌与硝化螺菌类NOB群落组成的变化；⑤土壤PNO的改变与硝化螺菌/硝化杆菌的丰度比率和它们的群落结构有关。这些结果表明，土壤中的亚硝酸盐氧化过程可能同时受到亚硝酸杆菌、亚硝酸螺菌这两种亚硝酸盐氧化菌的控制，而亚硝酸螺菌与亚硝酸杆菌分别又受到pH+TN和PH+SOC的限制。
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引：
Shun Han, Luyang Zeng, Xuesong Luo, Xiang Xiong, Shilin Wen, Boren Wang, Wenli Chen, Qiaoyun Huang, Shifts in Nitrobacter- and Nitrospira-like nitrite-oxidizing bacterial communities under long-term fertilization practices, Soil Biology and Biochemistry, Volume 124, 2018, Pages 118-125.
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0038071718301895
