2018-11-09
正文
最近，派森诺生物与中国农科院油料作物研究所合作，在《Food Research International》（影响因子3.520）再次发表论文，利用高通量测序技术，研究了白藜芦醇和芥子酸对因高脂饮食而引起的肠道菌群紊乱的作用，并探究这两种酚类物质的摄入对大鼠肠道菌群所造成的具体影响。
研究背景
高脂饮食（HFD）会引起肥胖，导致机体产生氧化应激、低度炎症反应与肠道菌群失调的症状。而肠道菌群在人体的营养和健康上起着关键作用，它们能够提供人体必需的营养物质、阻止病原菌的繁殖、维持粘膜免疫，并调节脂肪的储存与代谢，但也会受到遗传背景、免疫状态、宿主年龄的影响，并对摄入的饮食具有强烈响应。
氧化应激能够反应机体中活性氧簇的产生能力与活性中间体解毒能力之间的平衡关系，在人类与大鼠脂肪积累时氧化应激的增加是肥胖相关代谢综合征的一个重要疾病机制。
白藜芦醇与芥子酸是两种常见多酚类化合物，其中白藜芦醇具有抗炎抗肥胖的作用，可能可以改善血清的葡萄糖水平与胰岛素抗性。近年来，芥子酸与其主要衍生物被许多研究人员认为是有效的抗氧化、抗癌、抗菌和消炎药物。
目前，关于这些生物活性物质是否可在体外缓解氧化应激的研究还非常少，也鲜少有人研究芥子酸对肠道菌群的生物转化。因此，本研究分析了白藜芦醇、芥子酸，以及这两种酚类物质的混合物对高脂饮食引起的肠道菌群紊乱的影响，为后续研究多酚类物质对由高脂饮食所引起的，与肥胖和氧化应激有关的营养基因组改变的作用提供基础。
研究目的
1. 研究白藜芦醇和芥子酸对因高脂饮食而引起的肠道菌群紊乱的作用；
2. 分析白藜芦醇和芥子酸的摄入对大鼠肠道菌群所造成的具体影响。
研究方法
测序技术：Illumina MiSeq高通量测序平台
测序模式：微生物组细菌16S rRNA基因V3-V4区测序
实验对象：大鼠粪便
实验设计：将30只6周龄的雄性大鼠随机分成5组，分别以普通饮食（CT）、高脂饮食（HF）、混有白藜芦醇的高脂饮食（HFR）、混有芥子酸的高脂饮食（HFS），以及同时混有白藜芦醇和芥子酸的高脂饮食（HFC）喂养8周（见表1），每周记录一次大鼠的体重，每周监测两次进食量。最后在对大鼠实施安乐死的前两天，进行口服葡萄糖耐量试验（OGTT），在大鼠口服葡萄糖前后分别记录每只大鼠的血糖浓度，并于口服葡萄糖后的30 min、60 min、90 min时记录大鼠血糖浓度。收集大鼠粪便样本，并在干预期结束后的清晨采集空腹一夜的大鼠血液。最后解剖大鼠，收集肝脏与结肠组织。
采集的血液样品用于测量空腹血糖值、胰岛素水平、总胆固醇（TC）、甘油三酸酯、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）和非酯化脂肪酸（NEFA）浓度，以进行生物化学分析，大鼠肝脏与结肠组织则用于氧化应激检测，粪便样本用于通过高通量测序技术测定大鼠肠道菌群。
表1 各组大鼠的饮食策略
组名 | 饮食 | 重复数 |
CT | 普通饮食 | 5 |
HF | 高脂饮食 | 5 |
HFR | 白藜芦醇+高脂饮食 | 5 |
HFS | 芥子酸+高脂饮食 | 5 |
HFC | 白藜芦醇+芥子酸+高脂饮食 | 5 |
研究结果
血糖和脂质代谢平衡
实验数据显示（表2），各组大鼠之间的体重变化无差异，不过高脂饮食的大鼠中，喂食了白藜芦醇的两组大鼠，体重相对较低，而只在饮食中添加芥子酸的大鼠，体重并没有增加或减少。同时，喂食了白藜芦醇的大鼠血糖水平低于高脂饮食的大鼠，胰岛素抵抗指数（HOMA-IR）也有降低。如图1a所示，所有实验组的TC与LDL-c都没有差异，HFS组大鼠的TG和NEA水平低于HF组，HFR组的HDL-c水平高于HF组，且较高于CT组。
表2 大鼠体重指标与血浆生化指标
图1 摄食多酚对高脂饮食大鼠血脂（a）和葡萄糖耐受性（b）的影响
2. 口服葡萄糖耐量试验（OGTTs）
OGTTs实验显示，在给大鼠口服葡萄糖后的60-120 min内，相较于对照组大鼠，高脂饮食组大鼠（HFD）的血糖水平更高，这表明高脂饮食会损害葡萄糖耐受性。另外，HF组大鼠的AUC值（曲线下面积）也高于CT组大鼠，补充酚类的HFD大鼠在每个时间点的血糖水平都有所降低，芥子酸的摄入使HFD大鼠的AUC呈减少的趋势，但摄入白藜芦醇的两组大鼠和HF组大鼠的AUC值没有差异（图1b）。
3. 多酚物质对氧化应激的缓解
八周的高脂饮食，导致了大鼠肝脏、结肠与血浆中的氧化应激。芥子酸的补充，使血浆、肝脏和结肠中的ROS（活性氧）水平分别减少了13.5%、12.6%、27%，其中，只有结肠中ROS水平的减少具有统计学差异。而白藜芦醇的补充却并没有使大鼠任何部位的ROS水平有降低。MDA（丙二醛）是一种能够指示因ROS引起的生物膜损伤的醛类物质。只补充了芥子酸或白藜芦醇的大鼠在肝脏和结肠中的MDA水平都有降低，但在血浆中的MDA水平却没有改变，不过同时补充了两种酚类物质的大鼠肝脏、结肠和血浆中MDA水平的降低效果要比单独补充芥子酸和白藜芦酸的效果更好。补充了芥子酸的大鼠肝脏中的总抗氧化能力（T-AOC）得到了增强，但是血浆和结肠中的T-AOC却没有改善（表3）。
表3 各组小鼠肝脏、血浆和结肠中的抗氧化能力指标
4. 白藜芦酸与芥子酸对肠道菌群的调节
每组大鼠肠道菌群的Alpha多样性指数如图2a所示，HF组的OTU数目最少，而HFR和HFS组的OTU数较多，HFR、HFS、HFC这三组大鼠肠道菌群的Chao1和ACE指数都高于HF组大鼠，HFS组的丰度指数也高于HFR和HFC组，但每个组的Shannon指数与Simpson指数却没有差异。在菌群组成上，CT组大鼠的菌群与HF组大鼠明显区别开来，而HFS组的菌群也单独聚集，和HF组区分开来。HFR组的所有样本和HFC组的四个样本在聚类树上聚在一起。图2b的聚类树与图2c基于Unweighted UniFrac距离的NMDS分析都表明，相较于HFR组，HFS组大鼠粪便中的菌群和CT组更相近。
图2 各组大鼠肠道菌群的多样性和组成结构
在大鼠肠道菌群的主要细菌类群方面，门水平上，所有实验组中大鼠肠道里的细菌类群主要属于厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes），且高脂饮食使HFC组中的厚壁菌门细菌远多于HF或CT组，而每组样本中的拟杆菌门与变形菌门细菌（Proteobacteria）的丰度却并没有差异。HFR组中，厚壁菌门与拟杆菌门的相对比率要高于CT组与HF组。HFS和HFC组的柔膜菌门（Tenericutes）与放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度都要低于HF组。
在科水平的菌群组成上（图3b），HFS组大鼠的肠道菌群中，Unclassified RF39 family与Erysipelotrichaceae的丰度高于CT组。HFR组中只有很少的S24-7和Peptostreptococcaceae。另外，HFC组中的Lachnospiraceae与Peptostreptococcaceae丰度都高于HF组。
在属水平上（图3c），相较于CT组，高脂饮食使HFC组中含有更多的Roseburia，HFR中则含有更多的Unclassified Peptostreptococcaceae。相较于HF组，HFS和HFR组中含有更多的Blautia和Dorea。HFR组中Unclassified Ruminococcaceae的相对丰度高于HFC组。HFC组中Roseburia的的相对丰度也高于HF组。
图3 不同分类水平上肠道菌群的变化
5. 肠道菌群组成与宿主指标的相关性分析
通过斯皮尔曼相关性分析，研究了在各组大鼠肠道菌群中有差异的物种、多酚的摄食、血浆脂质与氧化应激相关参数之间的关系（图4）。该分析只保留了至少与两种生化指标相关的细菌，发现一些细菌与生化指标之间确实存在着相关性，比如葡萄糖和胰岛素都和Treponema，Adlercreutzia和Unclassified Coriobacteriaceae呈正相关，和Anaerotruncus呈负相关；血浆NEFA水平和Mucispirillum具有的负相关性，但同时也和Unclassified Flavobacteriaceae科的一个属呈正相关关系；甚至有十种以上的细菌类群和血浆TG具有的正相关关系。另外，Moraxellaceae科中的一个未分类细菌类群与Pseudomonas都和HDL-c呈负相关。在酚类物质方面，HFS大鼠肠道菌群中丰度较高的类群有Coriobacteriia，Clostridia和Erysipelotrichi、Bacilli、Gammaproteobacteria classes（Coprobacillus、SMB53、Coriobacteriaceae、Adlercreutzia、Pseudomonas和Streptococcus），而HFR大鼠肠道菌群中丰度较高的类群却是Blautia、Anaerotruncus、Sutterella和Bilophila，这些类群与Adlercreutzia和Coriobacteriaceae中的一个未分类类群与大鼠三种组织中的MDA值都具有正相关性。Actinomyces则和结肠与肝脏中的ROS水平都呈负相关。
图4 属水平上有差异的物种、多酚的摄入、血浆脂质与氧化应激相关参数之间的斯皮尔曼相关性分析
总结
本文通过研究不同饮食策略下大鼠肠道微生物菌群的变化，探究了白藜芦醇、芥子酸，以及这两种酚类物质的混合物对高脂饮食引起的肠道菌群紊乱的影响，并得到以下结论：
①白藜芦醇的使用降低了HFD大鼠的空腹血糖水平，增加了高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c）水平；②芥子酸的摄入降低了HFD大鼠结肠中的活性氧簇与丙二醛水平，肝脏中的总抗氧化力也增加；③多酚的摄入，会通过提高产丁酸细菌（Lachaospiraceae科中的Blautia和Dorea）的比例，并抑制与疾病和炎症有关的细菌（如拟杆菌和脱硫弧菌）的生长，在不同分类水平上都影响到了肠道菌群；④斯皮尔曼相关性分析显示，某些氧化应激的改变与肠道菌群的改变有直接相关性。
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引：
Chen Yang, Qianchun Deng, Jiqu Xu, et al. Sinapic acid and resveratrol alleviate oxidative stress with modulation of gut microbiota in high-fat diet-fed rats. Food Research International. 2018.
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0963996918307890
