2018-11-23
最近，派森诺生物再次与东华大学合作，在期刊《Water Research》（影响因子7.051）上发表文章，揭示如何提高利用有机废物生产高炫光性的L-乳酸的生物转化效率。
研究背景
为了缓解化石燃料危机和有机废物污染，通过生物降解有机废物来得到高附加值的乳酸已经引起了广泛关注。乳酸常常应用于食品工业，医疗，动物饲养和化学工业，特别是高炫光性（OA）的L-乳酸或者D-乳酸，有着更高的使用价值。而化学合成的乳酸只能生成外消旋混合物，微生物发酵可以产生高OA乳酸异构体。
近来发现电子发酵（EF）可以作为一种新型的生物电子化学系统，通过电极控制微生物发酵。但是目前对于从有机废物中转化为高OA乳酸的产生过程，即利用混合培养生物技术作为阴极电子发酵（CEF）这一过程还知之甚少。
本研究的目的是通过CEF系统提高具有高OA的L-乳酸的高产率，阐述乳酸生产过程中每一步的代谢途径。同时，讨论丙酮酸转化为乳酸的关键步骤和异构化反应，最后通过开放通路运行试验研究微生物菌群的结构变化和电子供体对乳酸生产的响应。
研究方法
测序技术：Illumina MiSeq平台
测序模式：细菌16S rRNA基因V3-V4区
实验设计：
废物处理厂的第二沉淀池中收集废活性淤泥，食物残渣收集自东华大学校内餐厅，并研磨成泥浆状，泥浆食物残渣用自来水稀释，再和废活性淤泥混合，稀释到一定程度作为发酵底物。
发酵实验批次 | 组名 | pH | 温度 | 电压 | 电极 |
A | T25 | NC | 25±1 | -300±5 | Cathode R-NV |
BT25 | / | / | |||
T35 | 35±1 | -300±5 | Cathode R-NV | ||
BT35 | / | / | |||
T50 | 50±1 | -300±5 | Cathode R-NV | ||
BT50 | / | / | |||
B | pHNC | NC | 50±1 | -300±5 | Cathode R-NV |
BpNC | / | / | |||
pH7 | 7±0.05 | -300±5 | Cathode R-NV | ||
BH7 | / | / | |||
pH9 | 9±0.05 | -300±5 | Cathode R-NV | ||
BH9 | / | / | |||
pH11 | 11±0.05 | -300±5 | Cathode R-NV | ||
BH11 | / | / | |||
C | Blank | 7±0.05 | 50±1 | / | / |
V+800 | +800±5 | Anode R-PV | |||
V+600 | +600±5 | ||||
V+400 | +400±5 | ||||
V-0 | 0±5 | Cathode R-NV | |||
V-100 | -100±5 | ||||
V-300 | -300±5 | ||||
V-500 | -500±5 |
图1 CEF系统原理图
3 研究结果
3.1 优化阴极法乳酸生产的发酵参数
图2阐述了阴极法产生乳酸的最佳温度和pH值，发现阴极法产生乳酸的最优发酵参数是pH值为7，温度是50℃。
图2 阴极法转化乳酸发酵温度和pH最优化选择
3.2 不同外加电压对乳酸产量的影响
图3A中可以看到施加不同外部电压情况下乳酸的产量，相比没有施加电压的Blank组，发现在V+800，V+600，V-0，V-100和 V-300条件下乳酸产出增加，特别是V-100组的乳酸表现出最高的OA。图3B表明V-0，V-100，V-300和V-500条件下乳酸的产出显著高于Blank。在图3C中解析了乳酸产生的时间进程，发现V-100组达到最大浓度的时间相对于Blank组缩短了一倍的时间，说明高OA总乳酸的产生最优电压是-100mV。
图3 不同电压条件下乳酸的产出量
3.3 乳酸产生的代谢途径
实际上，有机废物发酵成乳酸需要经过几个微生物代谢步骤，包括增溶、水解和酸化阶段。在增溶阶段，VSS和SCOD都没有表现出显著差异，所有试验结果都几乎在同一水平。在水解阶段，发现可溶性碳水化合物含量很快达到最高水平，随后也快速减少，结果表明施加电压并没有带来显著影响。在糖酵解阶段，单糖转化为重要的中间代谢物丙酮酸，从分析数据中发现丙酮酸在Blank组比R-NVs组中要高77.6%。在酸化阶段，丙酮酸转化为乳酸和VFA，在结果中VFA的浓度和组成在R-NVs和Blank中没有显著差异。结果说明采用阴极法进行发酵可能还是会影响到丙酮酸转化为乳酸的代谢过程。
图4 CEF系统中有机废物转化为乳酸的代谢过程
3.4 电子供给催化乳酸生成与异构化反应
CEF系统可以增强丙酮酸转化为乳酸，但是也需要进一步说明负电压对丙酮酸转化为L-乳酸还是D-乳酸的影响。图5A说明在不受原生有机废物基质的干扰条件下，模拟分批发酵试验是可以接受的。18h时，D-乳酸在Test-P和Ctrl-P组中是相似的，而L-乳酸在Test-P中是要比Ctrl-P中要高77.9%，说明在还原反应环境中丙酮酸更容易被转换为L-乳酸。
同时，异构化途径可以将D-乳酸和L-乳酸进行相互转化。图5B和C说明阴极法可能影响不了乳酸异构体化的反应，因为在结果中并没有发现D-乳酸和L-乳酸的增加。
图5 电子供给对丙酮酸转化为乳酸和异构化反应的影响
3.5外加电压作用下微生物群落的变化
电子加入到CEF系统产生了还原生态位，可能导致群落迁移和细菌丰度的变化。Chao1和ACE结果说明V-500组中细菌丰富度最高，但是V-300组中细菌多样性最高。通过图6可以比较门纲目科属的微生物物种组成变化，发现在门纲目水平上，R-NVs和Blank表现出相似的物种组成结果。而在科和属水平发现微生物菌群发生了变化，例如在Blank组中主要属物种是和乳酸产生相关的，分别是Caldicoprobacter和Clostridium，而其他各组中属水平的差异物种也都是与乳酸的产生有关，分别是V-0（Enterococcus和Caldicoprobacter），V-100（Caldicoprobacter和Lactobacillus），V-300（Caldicoprobacter和Clostridium）和V-500（Sporanaerobacter和Tepidimicrobium）。
图6 Blank，V-0，V-100，V-300和V-500组细菌菌群的组成
3.6 CEF系统短期进行乳酸生产的开放通路运行试验
通过研究结果推测微生物是通过阴极法直接接受电子供应，这可能影响了细胞代谢中乳酸产生的氧化还原对的稳态。图7结果表明不同时间进程发酵产出结果是相似的。但是24h后取消R-O开放通路试验中阴极的刺激，乳酸积累停在8.85g/L，96h后开始减少。相反，在48h时R-C中L-乳酸浓度提高到20.42g/L，72h时D-乳酸达到9.57g/L。说明阴极法为电子供给提供了保证提高乳酸生产量的机会。
图7 短期CEF开放通路试验对乳酸生产的影响
4 总结
利用CEF系统，显著提高了有机废物转化为乳酸的产量，也改善了L-乳酸的炫光性。电子供给促进了丙酮酸转化为乳酸，特别是L-乳酸。也发现影响到了科和属水平微生物菌群的变化，CEF系统中的阴极有利于电子供给保障有机废物转化为乳酸的快效率。
研究亮点
1、 在-100mV电压下，阴极法产出乳酸的产量提高了4.73倍。
2、 CEF系统中炫光性L-乳酸含量相比对照组中的3.6%增加到了42.3%。
3、 采用-100mV的电压条件下，丙酮酸转换为L-乳酸的效率提高了77.9%。
4、 科和属水平微生物菌群在CEF系统中发生变化。
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
参考文献
Xue G , Lai S , Li X , et al. Efficient bioconversion of organic wastes to high optical activity of l-lactic acid stimulated by cathode in mixed microbial consortium[J]. Water Research, 2017, 131:1-10.
原文链接：https://doi.org/10.1016/j.watres.2017.12.024
