2018-01-09
温热的南方，偶尔可见到一种“发型”很酷的卷羽鸡，羽毛蓬松翻卷，特性独立，在观赏鸡育种中颇受青睐；卷曲的羽毛还能促进家鸡散热，从而“淡定”应对高温，这对改善热带高温地区家鸡的生产性能也有重要的经济价值。
上海交通大学孟和教授课题组和广东海洋大学杜炳旺教授研究团队开展合作，采用群体基因组学策略，探究中国麒麟鸡卷羽特征的遗传机制。
材 料
（1）GWAS研究材料：选取麒麟鸡（卷羽）和怀乡鸡（正常）正反交构建F1、F2家系。选取F1代（18）、F2代（57）
（2）RNA-seq研究材料：3只麒麟鸡（KRC）、3只怀乡鸡（HX）的卵泡组织（发育13天的胚胎）
方 法
(1) 参考基因组：Gallus gallus (galGal5)
(2) 研究策略(ddGBS)：测序平台(Illumina HiSeq 2000)；平均测序深度：3 ×；
简化测序酶切组合：Pst I 和 Msp I。
(3) 软件：基因分型(BWA，GATK)；全基因组关联分析(PLINK)； RNA-seq分析(TopHat 2； DESeq R package)。
KRC（麒麟鸡）与HX（怀乡鸡）杂交种群的鉴定
KRC与HX的正反交实验表明，KRC的卷羽特征（图1）是由常染色体基因控制的不完全显性遗传，符合孟德尔遗传定律。
图1：卷羽与正常鸡的表型比较
成年的麒麟鸡（a、b）与正常的鸡（c、d）相比，羽毛卷曲性状明显；出生1天的麒麟鸡（e）就表现出卷羽特征。
全基因组关联分析(GWAS)
通过对F1（18只）和F2（28只纯合卷羽鸡、29只羽毛正常鸡）共75只鸡进行简化基因组测序，获得1464 million条reads，数据过滤后，与参考基因组比对，获得的1,948,658个SNPs，进行全基因组关联分析，进而定位与麒麟鸡卷羽性状相关的位点。
关联分析结果显示：共计获得32个与麒麟鸡卷羽特征相关联的SNPs位点(图2)。大多数主效的SNP位点位于KRT75L4 基因第5个外显子附近的130Kb的范围，其他的SNP位点位于F基因（KRT75L2、KRT5、KRT7 和KRT6A）的33号染色体附近1.19-1.52Mb范围内，位于33号染色体的候选的QTL位点与α-角蛋白基因家族重叠。
图2：麒麟鸡和怀乡鸡GWAS关联分析曼哈顿图
图a曼哈顿图显示所有SNP与卷曲羽毛表型的联系。不同颜色代表不同染色体，红色线为阈值线。图b为33号染色体的曼哈顿图。
麒麟鸡变异基因KRT75L4 的鉴定
前人报道的控制卷羽矮鸡的KRT75、KRT6A 基因并不是控制麒麟鸡卷羽的基因，通过对候选基因（KRT5、KRT6A、KRT75、KRT75L2 和KRT75L4）进行PCR扩增，结合sanger测序，发现KRT75L4 基因有15bp的缺失（图3），改变了编码蛋白的序列，造成麒麟鸡卷羽的特征。
图3：KRT75L4基因的15 bp缺失及其侧翼序列的荧光信号峰。
1,294,968的序列是参考基因组（Gallus_gallus-5.0）的33号染色体起始位点；参考基因组上、下序列分别来自HX和KRC个体，KRC缺失15bp；蓝色、红色背景分别为缺失的上下游序列。
RNA-seq分析麒麟鸡卷羽和正常怀乡鸡的基因差异性表达
对3只麒麟鸡（KRC）和3只怀乡鸡（HX）的卵泡组织进行RNA-seq，每个样品获得>37.4 million 的reads，分析结果显示，KRC和HX比较，共计有94个差异表达的基因(DEGs) ( |log2(K/H)| > 1; adjusted P-value < 0.05)。KRC与HX相比，50个基因上调，44个基因下调，进一步对差异表达基因进行功能分析，差异表达基因不在GWAS定位的33号染色体目标区段上，也不属于α-keratin基因家族。
麒麟鸡的KRT75L4 基因的表达水平与怀乡鸡一致，由于F型缺失，其转录产物较怀乡鸡短（图4），导致了Val-Leu-Pro-Ala-Ser转录产物的缺失，影响了编码蛋白的表达。33号染色体的其他α-角蛋白家族的基因的转录本在KRC和HX中是一致的，因此KRT75L4 基因可能是控制家鸡卷羽性状的F基因。
图4：KRC和HXC品种的KRT75L4 转录本可视化
HX group和KRC group的覆盖区域分别为橙色和绿色，在KRC group的三个样本中观察到中前区域的缺失的覆盖度，这是由于F型缺失导致的。
小 结
研究人员采用群体基因组学策略对麒麟鸡群体中受到选择作用的基因进行检测，并在其他家鸡群体中进行了验证，最终将候选基因锁定在第33号染色体的KRT75L4 基因。该基因和之前报道的KRT6A 基因同属α-角蛋白（α-keratin）基因家族，该基因家族在毛发生长中发挥着重要的作用。
此外，该工作表明群体基因组学分析可以应用于孟德尔性状（Mendelian trait）定位研究，相比于基于构建杂交谱系进行连锁分析的传统策略，群体基因组学分析显得更加简便易行。
参考文献
Dong J, He C, Wang Z, et al., A novel deletion in KRT75L4 mediates the frizzle trait in a Chinese indigenous chicken. Genet Sel Evol. 2018, 50(1):68. (doi: 10.1186/s12711-018-0441-7)
