2019-01-11
正文
最近，派森诺生物与上海东华大学再次合作，在《Waste Management》（影响因子4.723）发表论文，结合废弃物处理与发酵技术，探索了copper (II)对发酵系统中乳酸产量的影响，并利用高通量测序技术与PICRUSt代谢功能预测，研究了copper (II)在增强乳酸产能的过程中微生物群落的变化与相关机理。
研究背景
随着日益增加的生产速率，食物残渣（FW）与剩余活性污泥（WAS）成为了两种主要的城市有机废物，急需得到妥善处理，以减轻环境负担。厌氧发酵技术，能够转换有机废料（如食物残渣）中的碳，以生成具有高附加价值的化学制品。而WAS中也含有非常丰富的兼性微生物，可运用到发酵中。
乳酸是一种广泛运用在食品、化工和制药等诸多行业中的高价值化学制品，它的需求量年增长率高达15%，然而乳酸目前主要依靠接种乳酸菌，进行纯化培养得到，经济效率较低。而有机废弃物的厌氧发酵是一种获得目标产物的有效方法。
另外，金属在一些生物过程中起着重要作用，比如，激活代谢过程中一些关键的酶，促进微生物细胞生长。Copper (II)不仅是很多铜依赖性酶的辅因子，并在厌氧发酵系统中对丁酸与氢的产生有积极作用，还能阻碍D-乳酸转换为丙酮酸盐，同时，铜的添加还能使Lactococcus lactis subsp.的生物量增加，可能促进发酵系统中乳酸的产生。因此，本研究以食物残渣和废弃活性污泥为发酵底物，并在发酵系统中添加铜离子，以研究铜的添加对发酵系统中乳酸产量和微生物群落的影响。
研究内容
①测定铜等四种金属对乳酸产量的影响；
②研究铜的添加剂量对乳酸产生相关代谢过程的影响；
③研究铜的添加剂量对微生物群落结构与功能的影响。
研究目的
揭示Copper (II)在FW与WAS的联合发酵系统中对乳酸产量的影响，以及铜对厌氧发酵系统的各种有利影响。
材料与方法
测序技术：Illumina MiSeq高通量测序平台
测序模式：微生物组细菌16S rRNA基因V3-V4区测序
实验对象：食物残渣与废弃活性污泥混合的发酵底物
实验设计：①将打磨成浆的食物残渣与沉降后的浓缩废弃活性污泥，6:1混匀并添加自来水混和为发酵底物（表1），设立五个独立的发酵反应器，其中四个分别添加Fe3+，Mn2+，Cu2+和Mg2+（表2），每天取一次样，并用0.45 μm的滤膜过滤，测定L-乳酸和D-乳酸。
表1：发酵底物相关信息
②测定WAS中的初始铜离子浓度后，设立四个独立的反应器，分别命名为Blank，Cu-15，Cu-30和Cu-70，并分别添加不同剂量的铜离子（0，15，30，70μM-Cu2+/g VSS），每日取一次样，测定L-乳酸、D-乳酸、可溶性碳水化合物、可溶性蛋白质和NH4+-N的浓度。并通过FT-IR光谱法，在第四天测定Blank，Cu-15和Cu-70样本中的化学基团变化，在前三天测定α-葡萄糖苷酶和蛋白酶的酶活性。Blank和Cu-15中的样本还进行了EEM荧光光谱分析。
③当乳酸产量稳定后，从Blank，Cu-15和Cu-70中取样，利用Illumina MiSeq高通量测序平台，测定微生物组细菌的16S rRNA基因V3-V4区，以分析微生物群落结构与功能。
结果与讨论
▶ 金属离子对乳酸产量的影响
前三天里，添加了四种金属离子的发酵系统中乳酸的浓度如表2所示，在第一天时，四种添加了金属离子的发酵系统中，只有添加了铜离子的发酵系统，乳酸的浓度要比对照组高33%，其余金属离子对乳酸的产生都没有显著的积极影响，同时，添加铜离子的发酵系统中，乳酸的消耗率（CR）（42.72%）（表2）也远低于其它发酵系统。这表明，发酵系统中，铜离子的添加确实有利于乳酸的生产。
表2：五种发酵系统中的乳酸浓度
▶ 铜离子的添加剂量对乳酸产量的影响
添加不同浓度的铜离子后，各发酵罐中乳酸浓度随时间的变化如图1所示，铜离子的确对FW WAS联合发酵系统中乳酸的产生有积极影响，所有添加了铜离子的发酵系统的最高乳酸浓度都高于对照组，其中，Cu-15中的最高乳酸浓度为23.21 g/L，比对照组（13.11 g/L）高77%。不过，随着铜离子添加剂量的增加，乳酸的产量却呈降低的趋势，这表明，在发酵系统中添加合适剂量的铜离子，对乳酸的生产更有帮助。
同时，在整个发酵过程中，Cu-70的乳酸产生率在前两天都较低，这可能是由于铜离子对细胞的生长具有抑制作用。图1中，饼图展示的是对应发酵系统中乳酸浓度最高时，L-乳酸与D-乳酸的比例，可以发现，随着铜离子添加剂量的增加，D-乳酸的比例也呈增加的趋势。
图1 不同浓度铜离子的添加对FW与WAS联合发酵系统中乳酸产量的影响（图中饼图展示的是对应发酵系统中乳酸浓度最高时，L-乳酸与D-乳酸的比例）
▶ 铜离子对乳酸发酵代谢的影响
FT-IR光谱的测定结果显示，Cu-15和Cu-70发酵系统中固相吸收带的波数和对照组的波数相似，这表明，铜离子的添加并没有影响到发酵底物内部的化学键。四个发酵系统中，可溶性碳水化合物的最大浓度、1~3天内α-糖苷酶的酶活性和碳水化合物消耗率如图2所示。加入了铜离子的反应器中，α-糖苷酶的酶活性均要高于对照组，Cu-15中，碳水化合物的消耗率最高，随着铜离子添加剂量的增加，碳水化合物的消耗率降低，这表明，铜离子的添加可以通过增强糖酵解途径来提高发酵系统中乳酸的产量。
图2 各发酵系统中，可溶性碳水化合物的最大浓度、1-3天内α-糖苷酶的酶活性和碳水化合物消耗率
如图3所示，Cu-15中的蛋白酶活性低于对照组，peak A（蛋白类，Ex/Em = 290/360）与peak B（氨基酸类，Ex/Em = 360/450）都高于对照组，这表明，铜的添加能抑制水解，从而使系统中的蛋白含量增加。
图3 1~3天Cu-15与Blank中的蛋白酶活性（a）；Cu-15与Blank A峰与B峰荧光强度（b）；第三天时，Blank（c）与Cu-15（d）中发酵液的EEM光谱
发酵七天后，四个反应器中VFA（挥发性脂肪酸）的浓度与组成情况如图4所示，随着乳酸的消耗，Blank、Cu-15和Cu-30中的VFA都有极大程度的增长，而Cu-70中的VFA含量却一直保持在一个很低的水平上（0.47 ± 0.23 g/L），同时，Cu-70中VFA的组成也主要是乙酸，而其它三个发酵系统则是以乙酸和丙酸为主。
图4 发酵七天后，四个反应器中VFA的浓度（a）与VFA的组成情况（b）
▶ 铜离子的添加对微生物群落的影响
乳酸发酵的生物过程在很大程度上与微生物群落的结构有关。Blank、Cu-15和Cu-70中的微生物多样性指数如表3所示。Cu-15与Cu-70中的Shannon指数均低于对照组，数据分析显示，Blank与Cu-70只有502个共有OTU，而与Cu-15有848个共有OTU，即铜离子的添加使菌群发生了改变。
门和属水平下的微生物群落结构如图5所示。可以发现，铜离子的存在使微生物群落发生了显著改变，这三个反应器中的细菌主要属于Proteobacteria 和Firmicutes，这两种类群的微生物常见于活性污泥中，同时，Blank和Cu-15中分别有高达82%和88%的Firmicutes，而Cu-70中细菌类群则主要以Proteobacteria 为主，含量高达96%。
在属水平上，Blank中的细菌主要属于Lactobacillus（57.6%），Streptococcus（23.9%），Pseudomonas（2.0%），Dechloromonas（1.5%）；Cu-15则主要有Lactobacillus（86.2%），Leuconostoc（2.0%），Pseudomonas（1.8%）；而Cu-70中却以Acinetobacter（43.3%）为主。即随着铜离子添加浓度的增加，细菌微生物群落中的Lactobacillus和Streptococcus相对丰度显著减少，在Cu-15中丰度很高的Lactobacillus在Cu-70中只有0.05%，这表明，70 μM-Cu2+/g VSS超过了Lactobacillus的耐受性。
表3：Blank、Cu-15和Cu-70这三个发酵反应器中的多样性指数与OTU数统计
图5 门和属（相对丰度>0.1%）水平下Blank，Cu-15，Cu-70的细菌群落组成
▶ 微生物群落功能基因分析
PICRUSt功能预测分析的部分结果如图6所示。Cu-15中膜转运和碳水化合物代谢的相关基因丰度较高。同时，Cu-15中与遗传信息处理相关的基因丰度也较其它两个系统更高，这些基因与细胞生成和增殖密切相关，这可能也是Cu-15中乳酸产量最高的原因。图6b中是与复制和修复相关基因的丰度，可以明显看出，Cu-15中，与RNA聚合酶、翻译因子、DNA复制、DNA复制蛋白和蛋白折叠相关的基因丰度都高于其它系统。这表明，Cu-15中的自体调节系统活力较高。如图6c所示，Cu-70中，离子与电子传递载体相关的基因丰度非常高，这可能是因为铜会通过Cu2+与Cu1+之间的转换参与生物氧化还原反应。
图6 Picrust预测的部分KEGG第二等级分布图（a），复制与修复分类下的部分代谢通路相关基因分布（b），细胞过程与信号的部分代谢通路相关基因丰度分布（c）
总 结
本文结合废弃物处理与发酵技术，探索了copper(II)对发酵系统中乳酸产量的影响，并利用高通量测序技术与PICRUSt代谢功能预测，研究了copper(II)在增强乳酸产能的过程中微生物群落的变化与相关机理，得到以下结论：
①铜离子的确能增强发酵系统中的乳酸生产能力，当添加量为15 μM-Cu2+/g VSS时，发酵系统能比对照组高出77%以上的乳酸产量；
②铜离子的添加，能够增强α-糖苷酶与糖酵解酶类的活性，为后续的酸化过程增加了底物；
③当铜离子的添加量达到70 μM-Cu2+/g VSS以上后，会抑制乳酸转换为VFA，使乳酸浓度趋于稳定；
④少量的铜离子（15 μM-Cu2+/g VSS）会使产乳酸的Lactobacillus 增殖率达到82.6%；
⑤当铜离子的浓度相对较低时，微生物的自体调节系统是有活性的，同时，膜转运功能与碳水化合物代谢能力也很强。
本研究的测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Ye T, Li X, Zhang T, et al. Copper (II) addition to accelerate lactic acid production from co-fermentation of food waste and waste activated sludge: Understanding of the corresponding metabolisms, microbial community and predictive functional profiling[J]. Waste Management, 2018: S0956053X18301703.
原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0956053X18301703
