2019-02-15
文案 | 微生物基因组产品部
正 文
近期，派森诺生物与上海海洋大学合作，在《Frontiers in Microbiology》（影响因子4.019）发表论文，通过对大肠杆菌EC11菌株的全基因组研究，发现该菌株含有属于Incx4群的抗性质粒pEC11b，对粘菌耐药的mcr-1 基因正是被插入到pEC11b的2.6-kb mcr-1-pap2盒中。检测mcr 基因有助于跟踪、减缓中国畜牧业抗生素耐药性的出现。
研究背景
抗菌素耐药性正成为公共卫生面临的一大挑战。粘菌素（多粘菌素E）是一类阳离子多肽类抗生素，是治疗严重细菌感染的最后一道防线。尤其是用于治疗产生ESBL和CRE感染。
粘菌素耐药性被被认为是细菌的固有特性。然而，最近发现的携带mcr-1 基因的大肠杆菌，证实了水平基因转移（HGT）对粘菌素抗性的传播。mcr-1 基因的传播已经很明显，并有文献记载。
目前，研究人员已经发现了5个类似的基因，从mcr-1到mcr-5，它们都有一系列的mcr基因变体，如mcr-1.2、mcr-1.3、mcr-1.12。这些mcr基因已在多个生态系统中传播。接合质粒、转座子、整合子等移动基因元件是mcr-1基因水平转移的重要载体。接合质粒是mcr-1基因传播的主要驱动力，而IncI2和IncX4的质粒是促进大肠杆菌素耐药性传播的两种主要质粒类型。mcr基因的检测有助于追踪、减缓和应对中国畜牧业抗生素耐药性的出现。
本文通过使用细菌全基因组测序（WGS）来解析获取和转移该菌株中大肠杆菌素抗性的机制。
研究目的
探究大肠杆菌获得粘菌素耐药性机制
研究方法
测序技术：Illumina MiSeq+PacBio（二代+三代）
实验对象：携带粘菌素抗性质粒的大肠杆菌E.coli EC11
实验设计：分离出抗粘菌素大肠杆菌样本E. coli EC11，进行WGS分析，确定mcr-1 基因所在质粒，进行质粒转化实验。
研究结果
▶ E.coli EC11对抗菌和共轭化合物的敏感性
根据欧式标准，大肠杆菌EC11对多粘菌素B和甲氧苄啶磺胺甲恶唑有耐药性，对阿莫西林克拉维酸、氨苄西林等19种常用抗生素敏感（表1）。PCR结果显示，大肠杆菌EC11不携带β-内酰胺酶基因。双盘试验表明，大肠杆菌EC11是一种非ESBL产生菌株。
通过筛选交配试验，携带mcr-1 的质粒可以成功地从供体（EC11）转移到受体（大肠杆菌C600）。而转化结合的EC11-T对粘菌素的最低抑制浓度值为8μg/ml，与受体大肠杆菌C600（1μg/ml）相比增加了8倍。同时，EC11-T对纳利地西酸、甲氧苄啶、磺胺甲恶唑和多粘菌素B也有耐药性。
▶ mcr-1阳性大肠杆菌分离株的多样性
在文献综述的基础上，共鉴定出616株大肠杆菌中245株STs，表明该菌株具有高度的基因型多样性。Eburst分析将245个STs分解为10个克隆复合物（CC10、CC206、CC46、CCL114、CC648、CC101、CC642、CC6866、CC55和CC23）。CC10仍然是最多的克隆复合物，ST10被定义为CC10的祖先型（图1）。MLST分析表明，大肠杆菌EC11属于ST278家族。
这些类型分布在六大洲35多个城市，其中ST10分布在五大洲，中国是发现mcr-1 阳性大肠杆菌菌株最多的国家，共发现162个不同的STs。图2中的245株不同ST型mcr 阳性大肠杆菌分离株中7个看家基因片段的串联序列树，揭示了含有mcr 基因的大肠杆菌分离株分布在不同的谱系中，而分离的EC11位于单个分支上，不属于ST10分支之一。
▶ 含有mcr-1 的大肠杆菌EC11的基因组特征
全基因测序表明，大肠杆菌EC11菌株的血清型为H7。大肠杆菌EC11由一条染色体和四个质粒（pEC11a、pEC11b、pEC11c和pEC11d）组成（表2）。染色体基因组大小为4,933,784 bp，G+C含量为47.6%。EC11除发现mcr-1基因外，没有发现其他抗性基因。
WGS结果显示，mcr-1基因与大肠杆菌SHP45参考质粒pHNSHP45的mcr-1基因的相似度达到了100%。mcr-1基因仅位于质粒pEC11b上，长度为31,229 bp，平均G+C含量为41.40%，编码38个ORF（图3）。通过PlasmidFinder，质粒pEC11b具有典型的LncX4质粒的编码复制、接合装置和稳定性功能，这可能与质粒在不同细菌宿主之间的移动有关。同时，在大肠杆菌EC11的染色体上发现了gad（谷氨酸脱羧酶编码）、lpfa（长极性菌毛）和iss（血清存活铁蛋白增多）等假定的毒力基因。
▶ 携带mcr-1基因的质粒基因组特征
BLASTn分析表明，pEC11b质粒与已知的携带mcr-1基因的LncX4质粒非常相似，如E. coli pICBEC72H质粒、Klebsiella、pneumoniae pMCR1-IncX4质粒和Salmonella pNG14043质粒（图4），这些携带mcr-1基因的IncX4 质粒表现出非常高的结构保守性。
上述质粒pEC11b、PICBEC72H,pMCR1-IncX4和PNG14043中鉴定出约2.6kb长度的mcr-1-pap2元素。另外，在pEC11b中识别出IS6元素，在PICBEC72H和PNG14043中识别出IS26，在pMCR1-IncX4中识别出tnpA（图4）。
总 结
通过对分离的携带mcr-1基因的大肠杆菌EC11测序，在菌株的质粒pEC11b中鉴定出了携带mcr-1的lnx4型质粒，而在不同物种中携带mcr-1的lncx4质粒相似，这些物种来自不同的地理位置，属于不同的STs。表明mcr-1基因的大肠杆菌菌株可以通过水平转移传递抗性。因此，有必要监测和调查大肠杆菌素和其他类型抗生素的使用情况，以便采取积极的策略，保持抗生素的疗效。
本研究的测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Bai F, Li X, Niu B, Zhang Z, Malakar PK, Liu H, Pan Y and Zhao Y (2018) A mcr-1-Carrying Conjugative IncX4 Plasmid in Colistin-Resistant Escherichia coli ST278 Strain Isolated From Dairy Cow Feces in Shanghai, China. Front.Microbiol. 9:2833.doi: 10.3389/fmicb.2018.02833.
