2019-04-20
近日，派森诺生物与中科院植物生理生态研究所巫永睿研究组合作，在The Plant Cell发表了题为Maize VKS1 Regulates Mitosis and Cytokinesis during Early Endosperm Development的研究论文。该研究利用BSA的方法首次克隆和解析了马达驱动蛋白在玉米早期胚乳发育过程中的关键作用，揭示了早期胚乳细胞数目增殖决定最终籽粒大小的重要分子机理。
玉米胚乳早期发育是籽粒发育的一个重要阶段，伴随着快速而活跃的细胞分裂过程，短时间内形成大量的胚乳细胞，是决定玉米籽粒大小和产量的关键因素。
材料与方法
材 料
（1）BSA研究材料：突变体vks1（小粒）与A619（WT）回交6代，自交2代。群体BC6F2的子代突变体、正常的子代各极端表型约100个样本，构建混池；
（2）图位克隆材料：突变体vks1与自交系B73杂交，构建的BC1F1群体；
（3）RT-PCR材料：A619和vks1的籽粒发育时期0-24天的胚乳。
方 法
（1）混合分组分析法：BSA定位；
（2）图位克隆；
（3）RNA原位杂交、亚细胞定位、免疫荧光分析。
研究结果
利用BSA定位小粒突变基因
小粒突变体和正常籽粒各取约100株构建混池，与亲本A619分别建库测序，进行BSA定位分析。采用bwa软件的默认参数与参考基因组比对，GATK软件call SNP，过滤掉测序深度小于5x的reads。采用滑窗法（4Mb的窗口，200Kb的步长）计算突变池、野生池的SNP-index。通过计算突变池与野生池的SNP-index的差值Δ (SNP index)，将目标性状定位到7号染色体的端粒附近（图1）。
该区间内有64个候选基因，其中只有1个基因（Zm00001d018624）发生了非同义突变。进一步对该基因进行一代测序验证，证实该基因第8个外显子发生点突变，使密码子CGA变成TGA，导致翻译提前终止，基因的转录水平大幅度降低。作者将该基因命名为vks1。
图1 突变体的BSA定位结果
A图：子代混池的SNP-index在7号染色体上的的分布，从上至下依次为：突变混池的SNP-index，野生混池的SNP-index和二者的差值；B图：BSA定位区间内，Zm00001d018624 基因的结构示意图和在两个混池之间的测序序列分布图。
利用新的群体进一步确认候选基因
突变体与自交系B73杂交后构建BC1F1群体用于进一步确认候选基因。利用传统的图位克隆的方法，将候选区间缩小到了InDel8450和InDel5839标记之间（图2）。基于B73的参考基因组，这两个标记之间有7个基因被注。突变体的表型与纯合的TGA突变紧密连锁，正常的籽粒在该位点是杂合的，这也证实了基因Zm00001d018624 与突变表型是关联的。
图2 BC1F1群体vks1 的精细定位
左图：BC1F1群体定位的目标区间的分子标记在7号染色体上的物理位置；右图：BC1F1群体连锁分析，绿色三角形表示的正常种子的Zm00001d018624基因型为杂合，而突变种子的基因型为纯合。
进一步通过玉米的EMS诱变的数据库（MEMD）和玉米遗传合作中心（MGCSC）进行玉米的等位基因的反向基因筛选，来验证小粒的表型与Zm00001d018624 相关联。发现Zm00001d018624 的3种突变类型的突变体的种子与对应的野生型相比，均表现为小粒。
图3 vks1 基因结构与突变等位基因的示意图
红色矩形和黑色线分别表示外显子和内含子。填充三角形表示vks1-1、vks1-2、vks1-4至6等5个等位基因突变位点，空心三角形表示Mu插入的vks1-3等位基因。
另外，CRISPR/Cas9转基因互补实验的结果验了Zm00001d018624 基因变异导致了小粒突变表型。
vks1 基因的功能研究
通过表达实验，发现vks1 在籽粒发育的早期（授粉后2和3天）特异性高表达，并且在双受精后表达量显著增加，在2 DAP表达量最高，之后降低。通过原位杂交实验，发现2 DAP时，vks1 在多核体细胞中表达；3 DAP时，胚乳急剧细胞化。并且vks1 表现出胚乳的特异性表达，在母体组织（果皮和珠心）中未检测到表达。
图4 vks1 的表达量以及种子中2 DAP和3 DAP的RNA原位杂交分析
左上图：不同发育时期，vks1 的基因表达量；左下图：A619和vks1-1种子、B73和vks1-2种子中vks1 的免疫印迹分析；右图：vks1 在种子中2DAP、3 DAP的RNA原位杂交结果。
进一步构建瞬时表达载体，发现VKS1FL-GFP包含定位于皮质MTs和细胞核的整个VKS1 蛋白。通过免疫荧光方法观察到马达驱动蛋白VKS1 与有丝分裂过程中的微管共定位在一起，而突变体由于缺少VKS1 蛋白导致微管系统紊乱。
图5 VKS1FL-GFP的亚细胞定位
最后，在前面实验结果的基础上，作者提出了vks1 基因发挥功能的模型，来解释突变体籽粒大小不一致的现象。由于早期细胞分裂是一个快速而动态的过程，而每粒种子在这两个快速连续的过程中受到的影响程度不同，缺失vks1 后，重者则籽粒大部分早期胚乳细胞都是异常的，而轻者则只有少数细胞异常，早期胚乳不同细胞数目的异常导致细胞数目减少的程度不同，最终形成变异的籽粒大小。
图6 vks1 功能和籽粒表型变异的模型
总 结
BSA分析作为一种定位的方法，能够快速定位到控制表型的候选基因，大大缩短了实验周期。根据定位结果，对候选基因的功能进行进一步研究，是高分文章的必选哦。
本研究的BSA测序和分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
图7 第四届全国玉米生物学学术研讨会现场图，文章第一作者黄永财在大会做报告并致谢派森诺
参考文献
Huang Yongcai,Wang Haihai,Huang, Xing et al. Maize VKS1 Regulates Mitosis and Cytokinesis during Early Endosperm Development[J] .Plant Cell, 2019, DOI: https://doi.org/10.1105/tpc.18.00966.
