2019-05-11
正文
近期，派森诺生物与南京中医药大学合作，在《Frontiers in Microbiology》（影响因子4.019）发表研究论文，通过为期8周的糖尿病模型大鼠粪便微生物组多样性组成谱测序，实时展现了大鼠糖尿病发展进程中的肠道微生物组变化，为深刻认识微生物组在代谢疾病中的作用以及利用微生物干预治疗糖尿病提供了研究基础与治疗策略。
研究背景
Ⅱ型糖尿病（T2DM）是目前较为常见的代谢疾病，大量研究表明糖尿病患者的粪便微生物群落结构会发生显著变化。在T2DM研究领域，微生物是否可以用于减轻糖尿病病症仍是一个亟待解决的重要问题。由于人类伦理和样本数量的限制，通常采用小型动物模型对糖尿病动物粪便微生物进行研究。ZDF大鼠由于瘦素受体基因突变，能够诱发肥胖和胰岛素抵抗，并发展为T2DM，是T2DM研究的重要模型。通过ZDF大鼠研究模型的建立，可以更好地了解Ⅱ型糖尿病发展进程中肠道微生物组的变化以及微生物对糖尿病产生的影响。
研究目的
▶ 观察Ⅱ型糖尿病发展进程中的粪便微生物组动态变化；
▶ 为糖尿病治疗提供有效的微生物干预策略。
测序方法
测序技术：Illumina MiSeq高通量测序平台
测序模式：微生物组细菌16S rRNA基因V3-V4区测序
实验对象：大鼠粪便
实验设计：本研究使用4只雄性ZDF大鼠（表现为高胰岛素血症和高血糖），喂养Purina 5008食物8周（第8周至15周），共收集32份粪便样本，进行16S rRNA基因测序，以反映大鼠糖尿病发展期间的粪便微生物组成和变化；期间实时观察大鼠的体重、摄食量、饮水量、直肠温度、RBG（随机血糖）和OGTT（口服葡萄糖耐量试验）等生理特性，并采用非参数斯皮尔曼关联分析，评估ZDF大鼠生理特性与微生物的关系。
研究结果
ZDF大鼠8到15周龄的生理特性
与8周龄相比，ZDF大鼠在9到15周龄的体重显著增加（图1A）。从8到15周龄，ZDF大鼠的食物和水摄入量逐渐增加（图1B，C），直肠温度保持稳定（图1D）。8周龄ZDF大鼠RBG水平达到糖尿病状态（图1E）。在第14周进行OGTT实验，结果显示血糖浓度在30 min达到最高水平，然后逐渐下降，但直至120 min仍不能恢复至正常水平（图1F）。以上结果表明ZDF大鼠表现为糖尿病病理特征，其病情随着年龄的增长而加重、葡萄糖耐量受损、胰岛素敏感性降低。
图1 ZDF大鼠从8到15周龄的生理特性
二型糖尿病（T2DM）发展过程中微生物组多样性的动态变化
T2DM发展过程中Shannon和Simpson指数有着一致的变化，通过Simpson指数（SDI）分析可以发现，ZDF大鼠从9到12周龄SDI值逐渐增大，于12周龄达到最大值，13-15周龄有轻微的下降（图2）。聚类热图展现了不同周龄大鼠粪便中的主要菌属，各阶段不同的微生物菌属反映了微生物群落的多样性和动态变化（图3）。
图2 T2DM发展期间32份粪便样本Simpson指数的变化
ZDF大鼠糖尿病期间的核心微生物群落鉴定
加权UniFrac距离箱线图显示组间UniFrac距离大于组内UniFrac距离（图4）。门水平分类学组成分析表明5-15周龄ADF大鼠90%的微生物群落为Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria 和Proteobacteria，其中相对丰度最高的为Firmicutes（图5）。在8-9周龄，优势微生物为Firmicutes 和Bacteroidetes；从10-15周龄，Actinobacteria 相对丰度逐渐增加；在15周龄，Proteobacteria 显著增加。不同门的相对丰度在各周龄各不相同，表明ZDF大鼠有着动态的微生态系统。
图4 加权UniFrac距离箱线图
图5 门水平物种组成和相对丰度图
ZDF大鼠粪便微生物丰度的阶段性特点
加权UniFrac距离聚类热图显示8-10周龄与11-13周龄样本形成了两个明显不同的簇集（图6）。有些样本与同一组的样本聚类在一起（如12周龄），有些样本与相邻周龄的样本聚类在一起（如11-12周龄、13-14周龄）。
基于加权UniFrac距离的PCoA分析显示，8、9、10周龄样本沿着PC3轴聚集在一起，其余样本（11-15周龄）聚集在一起（图7）。共有和特有OTU花瓣图表明从8周龄到15周龄，有306个共有OTU，并且各周龄都有特有的OTU（图8），主要特有OTU属于Firmicutes、Bacteroidetes、Actinobacteria 和Proteobacteria。
图6 加权UniFrac距离聚类热图
图7 糖尿病不同发展阶段的粪便微生物组组成结构
图8 糖尿病不同发展阶段的共有和特有的OTU
ZDF大鼠微生物物种组成随年龄增长和疾病发展的变化
16个主要菌属的柱状图显示Lactobacillus 是ZDF大鼠糖尿病发展过程中丰度最高的属，Turicibacter 的相对丰度从8周龄到15周龄逐渐下降，Allobaculum 的相对丰度从11周龄到15周龄逐渐增加（图9）。差异分析（P<0.05）展示了随时间变化差异最大的15个属（图10），这些微生物的丰度波动表明在糖尿病的发展过程中微生物的群落结构是动态的。
图9 糖尿病发展不同阶段的微生物群落结构变化
图10 糖尿病不同发展阶段丰度变化最大的15个属
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ZDF大鼠的生理特性与失调的菌群有关
Firmicutes/Bacteroidetes（F/B）比值被广泛用于评价菌群失调。斯皮尔曼相关性分析显示F/B与大鼠年龄呈负相关（R=-0.35，P=0.04）（图11A），而F/B与体重、RBG、食物摄入量、饮水量和直肠温度等生理指标并没有显著相关性（图11B-F）。RBG与Lactobacillus（R = -0.42， P = 0.02）和Turicibacter（R =- 0.48，P = 0.004）的相对丰度呈负相关，与Ruminococcus（R = 0.45，P = 0.009）和Allobaculum（R = 0.37， P = 0.03）的相对丰度呈正相关（图12C，D），与SDI呈正相关（R = 0.44、P = 0.01）（图12E）。RBG与Bacteroides、Akkermansia 和Bifidobacterium 并没有显著性关系（图12F-H）。
图11 ZDF大鼠F/B比值与生理特性的相关性
图12 随机血糖水平和微生物群落变化以及Simpson指数之间的相关性
总结
本研究检测了8周龄到15周龄的ZDF大鼠在糖尿病发展进程中的粪便微生物群落结构变化，结果表明粪便微生物结构随着糖尿病的发展有着高度的动态性和显著的变化。
粪便微生物的时间依赖性变化为研究Lactobacillus、Turicibacter、Bifidobacterium、Allobaculum、Ruminococcus 和 Akkermansia 在糖尿病发展进程中的作用提供了支持。
本研究的测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Zhou et al. Dynamic Development of Fecal Microbiome During the Progression of Diabetes Mellitus in Zucker Diabetic Fatty Rats. Frontiers in Microbiology 10(2019):232.
