2019-07-19
文案 | 微生物组产品线
正 文
最近，派森诺生物与四川大学合作，在《International Journal of Food Microbiology》（影响因子4.006）再次发表论文，将特定功能物种Monascus purpureus（红曲）添加到四川麸醋的发酵装置中，并结合细菌16S rRNA基因测序与真菌ITS测序，分析了红曲的添加对麸醋发酵过程中微生物群落以及代谢物的影响。
研究背景
四川麸醋（SBV）是我国四大名醋之一，也是我国麸醋的代表。麸醋在制作中主要涉及糖化、酒精发酵和醋酸发酵这三个阶段，且每个阶段都与微生物密切相关。近年来，越来越多的研究者开始关注在醋的生产过程中微生物群落结构的改变，以期通过改善发酵过程中的微生物群落结构来提高醋的生产效率。有研究表明，投菌法能够提高中国传统固态发酵过程中代谢物的产生并调节微生物群落的多样性。
Monascus purpureus（红曲）是一种常见的功能性真菌，能够产生多种有价值的化合物，比如C-氨基丁酸、单胞菌素K和红色素，且已经被用到了福建红醋的生产中。因此，本文将研究红曲对四川麸醋，及其醋醅中主要代谢产物和微生物群落的影响，以期建立能够在麸醋生产过程中调节微生物群落及其代谢产物的生物调节技术。
研究内容与目的
探究红曲对四川麸醋及其醋醅中主要代谢产物和微生物群落的影响。
材料与方法
实验设计
01
制作添加了红曲的SBV发酵装置，室温发酵30天后，发酵混合物转变为新鲜醋醅，此时用盐覆盖将其催熟，然后将浸泡出的液体煮沸以得到新鲜的醋；随后将得到的部分醋醅混合到新的SBV发酵装置中，在第二次发酵成熟并用盐覆盖前，分别于发酵装置表面、中部、底部取醋醅样本，混合均匀后于-20℃存放;提取醋醅样本中的总DNA，用于高通量测序研究；测定生醋样本中的有机酸与挥发性成分。
表1 各发酵装置的处理信息
结果与讨论
1、醋醅中的微生物多样性
各样本中微生物的α多样性指数如表2所示，可以发现，添加红曲后，醋醅中真菌与细菌的微生物多样性均显著降低，且红曲对细菌多样性的影响要大于对真菌多样性的影响。
表2 各样本中真菌与细菌群落的Alpha多样性指数
基于主要细菌与真菌类群的热图分析结果显示（图1），添加红曲与未添加红曲的样本在聚类时被分为了两组，同时，对于添加了红曲的三组样本来说，由于H4中添加的红曲比例要高于H2和H3，其主要微生物类群也和H2、H3之间有所差异。
图1 醋醅样本中细菌（A）与真菌（B）群落中主要微生物类群的热图分析
NMDS分析显示，醋醅中的细菌与真菌的微生群落组成与结构均受到了红曲的影响，且H0与H4之间的菌群差异是最明显的。
图2 各样本中细菌与真菌群落的NMDS分析
不同醋醅样本中的微生物群落结构
本次研究在所有样本中测得的微生物类群主要归属于6个细菌门类、4个真菌门类，其中细菌主要以厚壁菌门和变形菌门为主，总相对丰度高达99%，真菌主要以子囊菌门为主，相对丰度高达96%。与此同时，不同红曲添加比例醋醅中的主要微生物类群也有明显差异（图3）。
图3 醋醅样本细菌（A）与真菌群落（B）中的主要微生物类群
2. 红曲对生醋中有机酸与主要挥发性物质的影响
本研究主要检测了6种有机酸，即乳酸、乙酸、L-焦谷氨酸、草酸、柠檬酸和L-苹果酸。结果显示，添加红曲后的生醋中总有机酸平均浓度是未添加红曲的两倍，其中，生醋中乳酸和乙酸的含量分别增加了2.12和1.84倍。
同时，本研究共检测到了59种挥发性成分，其中，主要挥发性成分共11种（见图4B），统计结果显示，红曲的添加对生醋中的挥发性成分具有显著影响，添加红曲后的生醋中酯类与醇类物质的浓度分别增加了1.3倍与2.55倍，且SBV中的原始主要挥发性成分并未受到红曲的影响。
图4 不同生醋中有机酸（A）与主要挥发性物质（B）的差异分析
微生物与代谢物之间的联系
SBV发酵过程中优势属的代谢图谱如图5A所示，木霉菌促进了纤维素与半纤维素的降解，并将它们转化为可发酵的单糖，随后发酵物质转化为了使乳酸与酒精发酵的关键代谢产物丙酮酸，同时，乳酸菌和念珠菌分别是参与乳酸和酒精发酵的主要微生物。
PICRUSt功能预测的结果显示（图5B），添加红曲后的样本中，参与氨基酸、碳水化合物（尤其是淀粉和蔗糖）、脂类、丙酮酸和苯丙氨酸代谢的功能基因丰度是未添加红曲样本的1.28~2倍，尤其是和苯丙氨酸代谢有关的功能基因，在H2、H3和H4中的丰度是未添加红曲样本的2.59、3.91和6.68倍，除此之外，预测结果显示，一些参与TCA循环的基因丰度也有所增加。
综上所述，添加红曲后，样本中的微生物群落发生了改变，功能预测结果中，参与氨基酸、碳水化合物（尤其是淀粉和蔗糖）、脂类、丙酮酸和苯丙氨酸代谢的基因丰度也得到增强，这些在实验中表现为生醋里对应的代谢物的积累（β-苯乙醇、乙酸苯乙酯、柠檬酸和L-苹果酸）在添加红曲后明显增加。
图5 发酵过程中优势属的代谢图谱（A），醋醅样本中细菌群落的PICRUSt代谢功能预测结果（B）
总 结
本文结合了细菌16S rRNA基因测序与真菌ITS测序，分析了红曲的添加对麸醋发酵过程中微生物群落以及代谢物的影响，并得到以下结果：
本研究的测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Ai M, Qiu X, Huang J, et al. Characterizing the microbial diversity and major metabolites of Sichuan bran vinegar augmented by Monascus purpureus[J]. International journal of food microbiology, 2019, 292: 83-90.
