2019-08-21
文案 | 基因组产品线
近日，派森诺生物与江苏省农科院兽医研究所携手，在微生物基因组领域 American Society for Microbiology 的《Antimicrob. Agents Chemother》（影响因子4.715）成功发表！
本研究的目的是探索大肠杆菌（E. coli）对氟喹诺酮（fluoroquinolone, FQ）类抗生素的遗传特性、耐药模式和耐药机制。将之前临床获得的E. coli活化后进行药敏实验和分子分型检测。目前已知的FQ耐受机制有：
▶ 靶位点变异；
▶ 质粒携带的获得性耐药基因（PMQR基因）；
▶ 相关的分子外排泵和孔蛋白相关的表达基因的变化。
本研究用DNA测序和qPCR的方法检测对上述3种耐药机制的相关基因做检测，利用高通量测序技术对其中有代表性的11株菌进行重测序，并检测SNP位点。
实验材料
用Salmonella Typhimurium CVCC541饲喂孵化4天的鸡仔，被感染的鸡仔被随机分成5组，然后从第8天连续7天分别喂食这些鸡仔不同剂量（100, 4, 0.1 and 0 mg/kg b.w.）的恩诺沙星（enrofloxacin）然后停药7天，重复3轮。分别在3, 7,8, 11, 14, 15, 18, 21, 22, 25, 28, 29, 32, 35, 36, 39, 42, 43, 46和第49天取鸡仔的肛门擦拭取样，并涂布在不同含量（0, 0.125, 0.25 and 2 mg/L）的恩诺沙星的固体培养基上，每个时间点取2个克隆。用生化检测和16s鉴定的方法鉴定培养基上的大肠杆菌。
本研究共分离到330个大肠杆菌，其中115个菌株从中等用药组（4 mg/kg b.w.）的第46天和49天分离得到；215株高剂量（100 mg/kg b.w.）用药组的第35天到第49天分离得到。低剂量用药组和空白对照组没有分离出大肠杆菌。
图1 分离到的大肠杆菌随时间变化对几种药物的最低耐药剂量分析
Fig. 1 MIC distributions of the E. coli isolates to enrofloxacin, amoxicillin/clavulanic acid, ampicillin, sulfamethoxazole/trimethoprim, gentamicin, tetracycline, chloramphenicol and ceftiofur along with time
从上图可以看出，分离到的大肠杆菌对不同的药物均产生了一定程度的耐药性，这表明从喂食恩诺沙星治疗感染沙门氏菌（Salmonella）的鸡仔身上分离得到的大肠杆菌有多重耐药性。可以推测恩诺沙星诱导了大肠杆菌产生了多重耐药性。
根据这些菌的遗传特征、毒力因子基因型、ERIC-PCR(大肠杆菌细菌基因组指纹分析)、最小抑菌浓度（MICENR）和质粒介导的喹诺酮抗性基因（plasmid-mediated quinolone resistance, PMQR genes）被分成18个亚群。
表1 根据遗传特征、恩诺沙星敏感性和抗药机制将分离到的大肠杆菌分为18个亚群
Table 1 Eighteen subgroups of the E. coli isolates classified by genetic characterizations, susceptibility to enrofloxacin and resistance mechanisms
从每个亚群中挑出1个代表菌株和非耐药菌株E. coli ATCC25922菌株一起检测编码外泵蛋白的基因（acrA, mdfA, ydhE, acrE, tolC, mdtE 和mdtF）及其调控基因（marA, soxS, fisF, dsrA 和evgA）和孔蛋白编码基因（ompC 和ompF）的表达情况。结果如下图：
图2 外泵基因、调控基因和孔蛋白基因的表达水平
Fig. 2. Relative expression levels of effux pumps. Porins and regulators.
备注：不同颜色的柱子代表菌株的MIC（蓝色，MIC=8 mg/L；紫色，MIC=16 mg/L；红色，MIC=32 mg/L；黄色，MIC=64 mg/L；绿色，MIC=128 mg/L；灰色，MIC=256 mg/L）
与对照组（ATCC 25922）相比，18株分离菌的外排泵编码蛋白相关基因（acrA, acrE,tolC, mdtE, mdtF, mdfA, ydhE）的表达都有一定的增加。孔蛋白编码基因ompF 的表达量在耐药性较低的6个菌株中有显著降低，在耐药性高的菌株中无显著差异；ompC 基因的表达量在17个菌株中显著增加，在1个菌株中有轻微降低。5个相关的调控基因（marA, soxS, fisF, dsrA, evgA）在18个菌株中的表达各有差异。
根据这些基因的表达情况，筛选了11个菌株做高通量测序，得到的数据以E. coli CVM N37067PS为参考基因组做重测序分析，鉴定单核苷酸多态性（SNPs）位点。我们着重分析在11个测序样品中都有，或在7个高耐药菌株中有在4个低耐药菌株中没有的SNP位点并验证。
最终找到了GyrA 基因上的双突变（S83L和D87N），基因ParC 和ParE 突变S80I和S458E，分子外排泵和QnrS1 蛋白的激活；低耐药性主要与孔蛋白OmpF 的表达降低，分子泵的活性以及基因aegA上的A1541G突变有关，其中基因aegA 上的A1541G变化可以将E. coli 的MICENR降低一半。
结 论
1、从用恩诺沙星治疗感染了Salmonella 的鸡仔肠道中分离出来的大肠杆菌具有多重耐药性；
2、孔蛋白编码基因ompF 的表达量在耐药性较低的6个菌株中有显著降低，位于质粒上的基因qnrS1编码的蛋白具有显著降低大肠杆菌的耐药性，同时ParE 基因对提高菌株的耐药性有明显作用；
3、基因aegA上的A1541G变化可以将E. coli 的最小抑菌浓度MICENR值降低一半。
本研究的大肠杆菌重测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Li J, Hao H, Dai M, Zhang H, Ning J, Cheng G, Shabbir MAB, Sajid A, Yuan Z. 2019. Resistance and virulence mechanisms of Escherichia coli selected by enrofloxacin in chicken. Antimicrob Agents Chemother 63:e01824-18. https://doi.org/10.1128/AAC.01824-18.
