2019-09-05
最近，派森诺生物与中国农业科学院合作，在《Biology and Fertility of Soils》（影响因子4.829）发表论文，探讨猪粪废水交替沟灌处理后土壤中氮的主要转化过程、细菌和真菌的群落组成以及氮循环相关基因相对丰度的变化。
研究背景
循环利用营养丰富的牲畜废水并将其用于灌溉是一种有吸引力的方法，可缓解缺水压力，捕获植物生物量和土壤中的氮和其他营养物质，并以有管理的方式处理废物。富营养化废水灌溉可能改变土壤的氮转化，包括硝化、反硝化、固氮、厌氧氨氧化和完全氨氧化。N2O是比CO2强300倍的温室气体，也是造成臭氧消耗的原因。因此，减少其耕地排放是必要的。
在干旱和半干旱地区，交替沟灌（AFI）已被开发为一种有效的节水灌溉方法。AFI交替灌溉相邻的两个犁沟，使根系长时间保持在干旱犁沟中，刺激脱落酸（ABA）的合成，试图降低叶片气孔导度，最终降低植物蒸腾作用。与传统的沟灌相比，AFI具有降低N2O排放的潜力，但其对土壤中氮循环基因丰度的影响尚不清楚。
研究目的
鉴于AFI和灌溉中废水使用的增加，作者研究了在AFI下用不同量猪粪废水灌溉的辣椒田中氮循环基因的丰度和主要氮转化过程的响应。对于每种处理，都有地下水灌溉对照。在所有处理和对照中，测量了主要的氮转化活性、氮循环基因的分布、细菌和真菌群落的组成，并分析了它们与土壤因子的关系。这将填补用废水交替沟灌如何影响氮转化活动及其相关基因的知识空白，为干旱半干旱地区畜牧业废水的可持续利用提供氮管理参考。
材料与方法
测序技术
Illumina MiSeq高通量测序平台
测序模式
微生物组细菌16S rRNA基因V3-V4区测序
实验设计
实验中使用的植物是辣椒
（Capsicum annuum L.，Fulong F1），
样品是种植辣椒的土壤。
表1 分组设计
结 果
1、土壤化学性质的变化
AFI处理后的土壤NO3--N含量明显低于CFI处理，在块状土壤中差异显著（80%）。对于土壤中的交换性NH4+-N，50%和60%比例地下水的AFI比根际和块状土壤的CFI含量高，65%和80%比例废水的AFI和块状土中50%比例废水的AFI差异不显著。地下水灌溉下土壤pH比污水灌溉下高，而OM、TN和NO3−-N含量以及C/N比则相反。在所有处理中，块状土壤的EC和NO3−-N均高于根际，而OM和交换性NH4+-N则相反。三种AFI处理土壤化学性质无显著差异。
表2 不同处理土壤的化学性质
2、N转换活性
废水处理的总氮输入高于地下水处理，但废水处理的氮利用效率明显较低。水源对氮素利用率有显著影响，而灌溉量对氮素利用率无显著影响。各废水灌溉率间氮素利用率无显著差异。与CFI相比，AFI显著提高了地下水处理的N利用效率，且在较高的AFI比例下，其效率有所提高，但并不显著。在不同水源条件下，3种AFI处理下植物对N的吸收差异不显著，但是CFI时植物N吸收显著低于80%比例地下水灌溉的AFI，同时CFI植物N吸收显著高于50%比例废水灌溉的AFI。根际硝化速率受水源的影响较大，但不受灌溉量的影响。地下水灌溉体土壤硝化活性无显著差异;在污水灌溉的块状土壤中，80%的AFI的硝化活性明显高于50%。不同水源、不同灌溉量下土壤的反硝化速率无显著差异。废水灌溉根际，CFI的反硝化活性高于AFI处理，且明显高于65% AFI处理。所有土壤中均未发现固氮现象。
图1 土壤的硝化速率和反硝化速率。
RS为根际，BS为块状土壤，G为地下水，W为牲畜废水，C为常规沟灌，A为交替沟灌。100、50、65、80分别为每小区全部灌溉水量的100%、50%、65%、80%。数据用均数±标准差表示。不同的小写字母代表处理组间差异有统计学意义（p < 0.05）
3、细菌和真菌群落结构
稀疏曲线表明测序深度足以覆盖微生物多样性。土壤类型（根际与块状土壤，R2 = 0.107，p = 0.002）和灌溉水源（地下水与废水，R2 =0.222，p < 0.001）对细菌OTU均有显著影响。与地下水灌溉土壤相比，废水灌溉土壤中细菌OTU的变异性有所降低，但不同灌溉量并未引起细菌OTU组合的显著差异。对于真菌，只有根际和块状土壤的OTU存在显著差异（R2 =0.181，p < 0.001）。
图2 基于OTU加权UniFrac距离的
土壤细菌(a)和真菌(b)群落的无约束主坐标PCoA分析
4、细菌和真菌OTU的显著差异
对于细菌，与废水灌溉土壤相比，地下水灌溉土壤中OTU的丰度显著增加。根际土壤中丰度明显较高的OTU数量与块状土壤相似。各样本中的门和纲存在显著差异。比如，在地下水灌溉土壤中显著较高的OTU为Acidobacteria(占总OTUS的23.5%)或Gemmatimonadetes(22.6%)，而废水灌溉土壤中显著较高的则是Bacteroidetes(22.2%),α-Proteobacteria(22.2%),γ-Proteobacteria(20.2%)和Actinobacteria(14.1%)。对于真菌，地下水灌溉土壤中丰度显著增加的OTU数量高于废水灌溉土壤。根际和块状土壤丰度显著增加相关的OTU数量相同，与细菌OTU相似，但真菌的数量较少。对于根际丰度显著增加的OTU，在废水灌溉下显示出显著增加的OTU数量高于地下水灌溉，而在块状土壤中则相反。
图3 土壤中细菌（a）和真菌（b）OTU的数量
5、N循环相关基因的相对丰度
（荧光定量qPCR检测）
1）根际和土壤中的水质效应
根际和块状土壤的基因丰度受水源和灌溉率的影响显著。灌溉水源不同，N循环相关基因丰度存在显著差异。在根际，基因形成三组：第一组由amoB，nirK和nosZ组成，随着硝酸盐，反硝化速率的增加和废水灌溉土壤pH值的降低，丰度增加；第二个由nirS和nifH组成，与废水灌溉产生的OM和硝化速率增加密切相关；第三组由amoA组成，与地下室灌溉引起的pH增加显著相关。土壤pH、OM、硝酸盐和反硝化速率均与水源分离有关。硝酸盐浓度的增加和pH值的降低确实导致了大量的变异，并且与amoB基因丰度的增加和amoA基因丰度的减少有关；nosZ和nirK基因的丰度分别与EC和TN的增加有关。在废水灌溉条件下，硝态氮和全氮均有所增加，但受灌溉率的影响不同。
图4 土壤中N循环相关基因相对于施肥和耕作前的丰度
图5 根际（a）和块状土壤（b）中N循环相关基因丰度
与环境因子的冗余分析
2）交替沟灌与灌水量的影响
除amoA外，废水灌溉土壤的基因丰度均高于地下水灌溉。在不同灌溉比率下，无论水源是什么，基因丰度都存在显著差异，这一差异在块状土壤中比在根际更为显著。当用废水灌溉时，相对于CFI，AFI以50%比率显著降低了根际土壤中amoB，nifH和nirS的丰度，以及块状土壤中nosZ，nosZ / nirK和nosZ / nirS的丰度，但是增加了块状土壤中amoB和nifH以及根际土中amoA的丰度。随着AFI比率的降低，土壤中nifH的丰度增加。在块状土壤中，随着灌溉比率从50%增加到65%和80%，nirK丰度也随之增加，但灌溉比率越高，土壤丰度的方差越大。当灌水量由高减少到低时，两种土壤分区的amoB丰度均有所增加，amoA丰度在根际与amoB丰度呈相同的趋势，而在块状土壤中则相反。根际中对于nosZ基因编码的亚硝酸盐还原酶在50%比率下的丰度显著高于其他两种比率。
总 结
该研究研究了不同灌溉比率下的地下水和废水来源AFI和CFI后土壤中N转化活性和相关N循环基因分布的差异。与CFI相比，地下水灌溉的AFI增加了植物氮素利用率。水质对基因丰度的传播有明显的影响：与地下水相比，废水灌溉对基因的响应性更强。相比于CFI，废水灌溉的AFI减少了根际中除了amoA之外的其他基因的丰度。废水灌溉下的AFI，增加灌水量可以增加根际土壤中nirK和nirS的丰度，降低amoA，amoB，nifH和nosZ的丰度，但是不会降低反硝化速率，同时保持块状土和根际土中反硝化速率不变，揭示了AFI的灌溉量并没有同时改变N转化过程和土壤中相关N循环基因的丰度。
研究结果表明，适当的灌溉比率具有提高氮素利用率的潜力，具有重要的应用价值。
本研究的测序和部分数据分析工作
由上海派森诺生物科技股份有限公司完成
文章索引：
Liu Y , Neal A L , Zhang X , et al. Increasing livestock wastewater application in alternate-furrow irrigation reduces nitrification gene abundance but not nitrification rate in rhizosphere[J]. Biology and Fertility of Soils 2019.
