2019-10-06
期刊：《Science of the Total Environment》
影响因子：5.589
近期，派森诺生物与中国科学院生态环境研究中心合作，在《Science of the Total Environment》（影响因子5.589）发表论文。本研究以人工湿地不同运行阶段、不同区域的沉积物样本为研究对象，结合氨氧化古菌（AOA）amoA功能基因的荧光定量PCR和二代高通量测序技术，展现了AOA在人工湿地系统中的时空变化，深化了人们对人工湿地建立初期古菌氨氧化作用的认识。
研究背景
氨氧化古菌（AOA）广泛分布在环境中，对氨氧化过程有着十分重要的作用。AOA的生理和生化特点决定了它们的进化和对特定环境的适应。AOA多样性和群落结构可以改变环境中的氮水平、温度、pH、植物种类和盐分等，而环境因素可以改变AOA的行为、结构和演变。
人工湿地（CWs）能够有效减少水中的营养物质、化学物质和微生物，该处理系统可能导致一些环境因素的变化，如土壤结构特征、营养水平、土壤温度、有机物含量和水质等，因此可能会影响AOA的群落结构。目前，人们对湿地生态系统演替过程中的AOA群落结构时空变化认识较为匮乏。
研究目的
1. 探究人工湿地SJY-CW沉积物中AOA丰度、多样性和群落结构的时空变化；
2. 探究AOA群落演变过程中的重要影响因素。
研究方法
测序技术：454高通量测序平台
测序模式：氨氧化古菌amoA功能基因测序
实验对象：湿地沉积物
实验设计：
图1 SJY-CW湿地取样图解
主要研究结果
1. AOA在SJY-CW沉积物中的丰度
AOA amoA基因在SJY-CW沉积物中的拷贝数如图2所示。总体而言，amoA基因的拷贝数从2011年到2013年逐渐减少，但是其拷贝数在湿地的不同区域有着不同的变化模式。在所研究的3年当中，amoA基因丰度在湿地的inlet和outlet区域十分相近。在2011年和2012年这两个区域amoA的基因丰度几乎在一个水平，在2013年两个区域的基因丰度骤减。与inlet和outlet区域相比，plant-bed系统（West、South和North区域）有着更高的AOA amoA基因拷贝数。此外，amoA基因丰度在plant-bed系统的3个区域有着明显的地域差异，并且随着SJY-CW的运行丰度逐渐减小。South区域作为湿地的中心净化区域，有着最高的AOA amoA基因拷贝数。这些变化模式表明，AOA的丰度变化更容易发生在plant-bed系统。
图2 SJY-CW运行3-5年期间AOA amoA基因在沉积物中的拷贝数
2. AOA在SJY-CW沉积物中的多样性
本研究通过454-扩增子测序探究AOA amoA基因在SJY-CW沉积物中的多样性。15个测序样本共获得42159条高质量序列，平均长度为519 bp（359-675 bp）。Good’s coverage指数表明本研究的测序量能够覆盖湿地沉积物中的AOA群落（表1）。每个样本的测序深度归一化到1500条reads，所有序列以97%的相似度聚类，得到79-224个OTU。各样本中AOA amoA 基因的多样性指数如表1所示。
结果表明随着SJY-CW的运行，AOA多样性逐渐减少。在所研究的3年当中，AOA在outlet区域的多样性高于inlet区域。在plant-bed系统中，West区域与其他两个区域相比有着更高的AOA多样性。总体而言，AOA多样性保持着一个相对稳定的状态（Shannon H 指数：2.98-4.44，变异系数：11.17%）。
表1 AOA amoA基因在SJY-CW沉积物中的多样性
3. AOA在SJY-CW沉积物中的群落结构
AOA在SJY-CW沉积物中的相对丰度如图3所示。与数据库比对发现，SJY-CW沉积物包含广泛的AOA类型。在所有序列中，有87.26%属于Nitrososphaera cluster，只有7.88%、4.22%和0.64%分别属于Nitrosopumilus cluster、Nitrososphaera sister cluster和Nitrosotalea cluster。尽管每个样本的优势物种均为Nitrososphaera cluster，其余3类AOA clusters的相对丰度在SJY-CW运行的第4和第5年逐渐增加（图3），表明在湿地系统运行的过程中，AOA群落结构由相对均匀的分布向高度多样化转变。
图3 AOA amoA基因簇在SJY-CW沉积物中的相对丰度
Nitrososphaera cluster可以被分为7个主要的subclusters（subclusters 1、3、4、6，8-10），Nitrosopumilus cluster可以被分为subclusters1和5（图4）。Nitrososphaera cluster 9、3、10和4为绝大多数样本中的优势物种，除了2013-North和2013-Outlet两个样本。而2013-North的优势物种为Nitrososphaera subcluster 9和Nitrosopumilus subcluster 5，2013-Outlet的优势物种为Nitrososphaera subclusters 10和1。Nitrososphaera subcluster 1和Nitrosopumilus subclusters 1、5可以标志湿地的具体区域。Nitrososphaera subcluster 1在样本2013-Outlet有着显著的增长趋势。Nitrosopumilus subclusters 1、5在沉积物中有着类似的变化趋势：2011年，Nitrosopumilus在每个区域都非常少；2012年，这两个subclusters在上游采样区增加；随后，随着湿地的运行，Nitrosopumilus逐渐减少，最后在湿地的末端区域表现为增加。
图4 AOA 群落在SJY-CW运行过程中的演化
4. AOA在SJY-CW沉积物中的群落结构变化
基于Bray-Curtis距离矩阵，SJY-CW沉积物中的AOA amoA基因库被分为8组（P<0.05）（图5）。图中的红色区域表示AOA群落的时空变化。这8个组没有按运行时间（运行年份：2011-2013）或采样区域（Inlet、West、South、North和Outlet）而表现为时间和空间的交互分隔。结果表明随着SJY-CW的运行，AOA群落结构有着空间的分化，并且主要发生在Plant-bed系统中。
图5 基于Bray-Curtis距离的UPGMA聚类图
RDA冗余分析显示3年的样本只有部分相互重叠，表明AOA的群落结构主要受SJY-CW次生演替的影响（图6）。在空间维度，5个不同区域的样本在2011年距离较近，在2012年和2013年距离加大，进一步表明AOA群落结构由相对统一到加大多样性分化。同时，RDA分析展现了AOA群落结构和环境因子的关系。环境因子解释了AOA组成总变异方差的50%。其中Days（运行时间，F=1.5145，P=0.055）综合反映了水文、水质及相关功能，对SJY-CW沉积物中AOA结构与环境的关系具有重要意义；温度和营养成分（NH+4-N、TC、TN、TS和C/N）对AOA群落结构也有重要影响。
图6 AOA群落结构和环境因子的RDA分析
总结
本研究通过实时荧光定量PCR技术、454-扩增子高通量测序技术，结合聚类分析和RDA冗余分析，得出以下结论：
1. 氨氧化古菌AOA群落结构在SJY-CW运行的第三到第五年中有着很大的时空变化；
2. AOA的绝对丰度在复杂的plant-bed系统显著高于其他较均匀的取样区；
3. 随着湿地系统的运行，AOA群落结构由较均匀的分布到多元化转变；
4. 湿地系统的运行时间对AOA的群落结构有主要影响，温度、营养元素影响次之。
本研究的测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引
Weidong Wang et al. Spatiotemporal shifts of ammonia-oxidizing archaea abundance and structure during the restoration of a multiple pond and plant-bed/ditch wetland. Science of the Total Environment 684 (2019) :629–640
