2019-10-31
近期，派森诺生物与华中农业大学合作再传捷报，蔡鹏教授和吴一超副教授领衔的团队在《Environment International》（影响因子7.943）发表重要研究论文，以土壤微生物为研究对象，结合16S rRNA基因高通量测序和多种分析手段，深入探究了土壤生物膜形成机制及其对土壤微生态的重要影响，可喜可贺！
据估计，多数微生物以生物膜的形式存在于自然环境中。越来越多的研究表明，土壤微生物主要以生物膜的形式存在，由一种或多种微生物形成的生物膜附着于多种物体如矿物表面、空隙空间、植物根系等。在生物膜形成过程中，微生物胞外聚合物（Extracellular polymeric substances，EPS）被排出体外，形成生物膜基质支架，以介导表面结合并维持生物膜的黏附性。生物膜的形成可帮助微生物获得生态优势，如抵抗干燥环境、增加水平基因转移机会，增加其生存能力。同时，土壤生物膜的形成也影响着土壤的理化性质，改变土壤的微环境。然而关于土壤基质中生物膜的发育过程、土壤生物膜形成的环境和生物决定因素，以及土壤生物膜对微生物代谢活性和群落结构的影响等仍有待深入研究。
1. 探究土壤生物膜形成的环境和生物决定因素；
2. 解析土壤生物膜对微生物本身代谢和群落结构的影响。
测序技术：Illumina MiSeq高通量测序平台
测序模式：微生物组细菌16S rRNA基因V3V4区测序
实验对象：土壤微生物组
实验设计：
1. 高养分输入诱导生物膜形成
本研究采用微孔板生物膜分析来评估养分输入对土壤细菌生物膜形成的影响。在最低养分水平下（glucose：0.58 mM，NH4NO3：0.13 mM），生物膜形成指标OD590/OD600值最低（4.85±1.12，P<0.01），细菌悬浮液光密度最高（OD600：0.11±0.01，P < 0.01），表明在低养分水平下生物膜形成较少、游离细菌较多。单独增加葡萄糖（5.77mM）或硝酸铵（1.25 mM）能够促进生成生物膜（OD590/OD600：10.25±1.62或8.36±1.58），减少游离细菌（OD600：0.08±0.01或0.06±0.01）。当碳源和氮源浓度共同增加至10倍时，生物膜生成量可增加至1.3倍（P<0.01）。该实验表明高养分条件是土壤生物膜形成的基础。
2. 人工土壤生物膜的生长和EPS的产生
为进一步了解土壤生物膜的形成，本研究采用人工土壤对土壤生物膜进行培养。在低养分水平下，伴随着葡萄糖的消耗，微生物生物量在前7小时增加了13%（图1A）。10小时以后，微生物生物碳从1700减少至1600 mg/kg。在高养分水平下，微生物有着相似的生长规律（图1B）：前10小时微生物生物碳增加至1700mg/kg；之后，尽管葡萄糖和硝酸铵还存在，微生物生物量逐渐减少。当葡萄糖耗尽时，高养分水平土壤中剩余的生物碳显著低于低养分水平（1260±18 vs 1586±24 mg/kg，P<0.01），而生物膜EPS显著积累。
完成整个培养周期后，通过SEM观察土壤生物膜形成状态。由细菌细胞和矿物颗粒组成的大量微米级团聚体在高养分水平下形成（图2A），而在低养分水平下并没有观察到此类团聚体（图2B）；通过CLSM观察到的现象与此类似（图2C-D）。由此表明，高养分输入促使人工土壤生物膜的形成。
图1 低养分（A）和高养分(B)条件下土壤微生物的生长和葡萄糖的消耗
图2 SEM和共聚焦图像显示多细胞生物膜在高养分条件下（A C）发育，而在低养分条件下不发育(B D)
3. 土壤生物膜的形成增加了微生物的多样性和均匀性
本研究通过16S rRNA基因测序来评估土壤生物膜形成过程中微生物的群落结构变化。人工土壤微生物接种后，在低养分水平和高养分水平下微生物多样性均减小。当养分物质耗尽后，形成生物膜的土壤微生物群落的Alpha多样性和均匀性指数显著高于未形成生物膜的微生物群落（表1）。
Acinetobacter和Bacillus为微生物群落属水平的优势物种（图3A）。在低养分水平下，Acinetobacter的相对丰度由73.7±2.8%增加至81.5±0.9%（P<0.05），而Bacillus的相对丰度维持在大约15%。在高养分水平下，Acinetobacter的相对丰度在最初的8h增加至81.4±0.9%（P<0.05），在96h后减小至74.6±0.8%（P<0.01）。在此条件下，Bacillus则表现出与Acinetobacter相反的变化趋势：在最初的8h，Bacillus的相对丰度由15.4±1.7%减小至10.6±2.5%（P<0.05），在96h又增加至21.3±2.0%（P<0.01）。由此可见，Bacillus相对丰度的增加、Acinetobacter相对丰度的减小是形成生物膜土壤与未形成生物膜土壤的主要区别。在主成分分析（PCA）中，Paenibacillus的箭头方向与Bacillus相近，表明Paenibacillus和Bacillus有较大的相关性（图3B）。
表1低养分和高养分条件下培养的土壤微生物群落多样性
图3 优势菌属热图（A）和属水平微生物群落结构的主成分分析（PCA），箭头代表17个最丰富的属，占总群落95%以上（B）
4. 土壤生物膜的形成增强了微生物的代谢活性
为评估土壤生物膜对微生物活性的影响，本研究测定了土壤中的氧气分布（图4A），结果表明微生物呼吸主要发生在表层土壤，有生物膜形成的土壤氧消耗量比无生物膜形成的土壤高65.4%（P<0.01）。尽管有生物膜的形成土壤微生物生物总量较于无生物膜形成更低，但前者更高的呼吸速率表明其更活跃的微生物活动并包含更多的高活性微生物。
为了解土壤生物膜对微生物代谢活性的影响，本研究在初始养分耗尽时额外添加葡萄糖和硝酸盐以观察有生物膜形成（前期高养分水平）和无生物膜形成（前期低养分水平）土壤中葡萄糖的消耗速率（图4B），结果表明有生物膜形成的土壤葡萄糖消耗更快，这与其表现出更高的呼吸速率相吻合。
为更好地解释生物膜对土壤微生物的动力学影响，本研究测定了基质诱导的呼吸反应。如图4C所示，有生物膜的土壤微生物有着更高的基础呼吸率（P<0.01），在基质诱导后，其呼吸速率变化更为迅速。本研究通过拟合实验数据确定了微生物动力学参数（表2）。有生物膜的土壤显著提高了生长耦合（Rc）和不耦合（Ru）呼吸速率，其活性微生物的比例（FAMB）以及活性微生物总量（TMB）显著高于无生物膜形成的土壤（P<0.05）。由此表明，土壤中生物膜的形成显著增加了活性微生物的占比，从而导致更快的养分转换速率。
图4土壤含氧量分布（A）; 初始养分耗尽后，土壤中添加了葡萄糖。葡萄糖的消耗表明，有生物膜的土壤对基质供应有快速反应（B）;基质诱导的土壤微生物呼吸（C）。模拟数据由实线表示具有生物膜的土壤，虚线表示带有自由细胞的土壤。
表2 土壤微生物动力学研究
本研究发现，随着养分供应的增加，土壤生物膜可以在人工土壤中被激发，高养分条件是生物膜形成的先决条件。虽然在高养分条件下生物量的增长较低，但胞外聚合物EPS的产量明显增加，微团聚体得到了发展；16S rRNA基因测序分析表明，有生物膜形成的土壤微生物多样性和均匀度指数明显高于无生物膜形成的土壤，Bacillus 和Paenibacillus是土壤生物膜形成的关键物种。土壤生物膜形成后，微生物的代谢速率显著加快。以上结果对认识土壤生物膜的形成、了解生物膜对土壤微生态的影响有重要意义。
本研究的高通量测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引：Y. Wu et al. Soil biofilm formation enhances microbial community diversity and metabolic activity. Environment International 132 (2019) 105116.
