2018-04-26
派森诺生物与中科院水生生物研究所携手合作，通过 Illumina NextSeq500高通量测序平台，应用转录组测序方法，对草鱼呼肠孤病毒进行了基因转录水平的研究，对GCRV感染的草鱼肾（CIK）细胞转录水平的变化进行了分析，揭示了GCRV感染的机制。作者陈庚和通讯作者汪亚平关于GCRV转录组测序的研究成果《Transcriptomics Sequencing Provides Insights into Understanding the Mechanism of Grass Carp Reovirus Infection》于2018年2月6日发表在《International Journal of Molecular Sciences》上。
草鱼（Ctenopharyngodon idellus）是中国重要的水产养殖鱼类，2015年草鱼产量达到580万吨，占世界淡水养殖产量的13％以上。草鱼呼肠孤病毒（GCRV）可以引起草鱼的出血性疾病，该疾病是对草鱼具破坏性的疾病之一，会造成草鱼养殖业巨大的经济损失。近来，对GCRV的研究主要集中在鉴定参与GCRV感染免疫应答的基因，GCRV编码蛋白的克隆和鉴定，GCRV疫苗的开发等方面，对于GCRV侵袭和感染的机制仍有待阐明。
GCRV感染诱导细胞病变效应
模拟感染和病毒感染的细胞变化图
在模拟感染的细胞中未观察到细胞病变效应（CPE）。然而，在感染GCRV的细胞中，感染后8小时观察到CPE，并随着时间的推移变得更明显。感染后72小时，可以看到大部分细胞坏死.
CCK-8 kit细胞活力试验
细胞活力试验结果图
模拟感染细胞显示接近100％的生存力，而感染8, 24和72小时的细胞，仅观察到74.66％，56.88％和36.95％的细胞活力。因此，结果提示GCRV的感染是有效的。
转录组序列数据初步分析
PCA分析结果
对测序数据的整理可以看出，对于所有文库，Q20≥96％，Q30≥92％，比对百分比≥87％。这些结果表明了测序数据的高质量。根据表达水平对每个样品进行的主成分分析（PCA）结果表明模拟感染细胞明显不同于感染GCRV的细胞。此外，对于感染GCRV的样品的相关值与感染后时间成正比; 8小时的样本与24小时和72小时的样本不一致。
表达差异基因（DEG）鉴定
将GCRV感染过程分为三个阶段：早期（感染后0-8小时），中间（感染后8-24小时）和晚期（24-72小时）阶段。在每个阶段，将来自后一时间点的数据与前者进行比较（8与0, 24与8和72与24对比）以鉴定差异表达的基因（DEG）。
GO和KEGG富集分析
上表中列出了感染后三个阶段中富集的前五个GO Term信息。GO富集分析结果表明，感染的早期阶段主要与铁运输，碳水化合物代谢和包涵体有关。在感染的中期，铁离子结合，溶酶体类显著富集。同时，后期阶段主要与代谢过程有关，如脂质生物合成，类固醇代谢和酒精生物合成代谢。
上表展示了三个阶段中富集的前五个KEGG pathway信息。KEGG富集分析的结果则表明，在感染早期，DEGs主要涉及与局灶粘附，ECM（细胞外基质）-受体相互作用，细胞因子-细胞因子受体相互作用有关的途径。在中期，与病毒进入细胞和细胞识别有关的途径被富集，包括吞噬体，溶酶体和hippo信号通路。在感染后期，显著富集的途径是类固醇和类萜骨架的生物合成，以及酮体的降解。
在关键KEGG pathway中表达的DEG
选定的KEGG通路中DEGs的表达模式线图
进一步评估ECM-受体相互作用，局灶粘附，吞噬体和溶酶相关的关键KEGG pathway中DEGs的表达模式，对感染后每个时间点四种KEGG途径进行比较，结果显示，这些DEGs的表达模式存在显着差异。具体来看，与ECM-受体相互作用和局灶粘附相关的DEGs，如col5a1，itgb7和sptbn5在感染早期阶段上调，但在中期和晚期阶段下调。相反，参与吞噬体和溶酶体的DEGs的表达，如itgb2，srb1，和sel1呈现相反的趋势，在感染早期下调，但在中后期上调。
三个感染阶段关键DEG的鉴定
关键的DEGs可能在对环境变化的应对中发挥重要作用，因此会对它们进行识别和注释。分析的结果显示，感染后0至8h之间的大多数上调基因（例如ptpε，itga7和ppl）与细胞信号传导相关，而诸如cxcl10和ifi271的下调基因则与免疫相关。8至24 h间上调的基因包括viperin，tap1，tlr3和irf11。同时，下调的基因如angptl2，pgp和rap1gap1，主要与血管有关，这也可能解释了为什么草鱼在GCRV感染后会出现出血症状。其他下调基因包括蛋白质损伤修复相关基因，如mical3b和hspb11。最后，在24和72h之间，上调基因主要与程序性细胞死亡，细胞凋亡和炎症相关，与在24和72h观察到的较高的细胞活力降低结果一致。 此阶段的下调基因主要参与类固醇合成，而另一些则与微管和血管有关。
关键干扰素相关基因的表达模式
涉及免疫应答的关键基因的表达模式
本研究检测了关键的干扰素相关基因的表达模式。结果表明，除基因mx-1外，大多数基因在感染后24或72h显示为log2倍数变化≥2甚至≥10，而在感染后8h表达水平下降。这些结果说明了GCRV感染诱导的强免疫应答。
选定的DEG的 RT-qPCR验证
RT-qPCR验证转录组测序数据
为了证实RNA-Seq数据的可靠性，选择了参与吞噬体途径的8个基因进行RT-qPCR分析。验证的结果表明，通过qPCR获得的所有8个DEG的表达模式与来自RNA-Seq分析的表达模式相似，尽管相对表达水平不完全一致。 因此，RT-qPCR分析的结果证实了RNA-Seq数据的可靠性和准确性。
结论：
研究表明，在感染早期，GCRV与多糖相互作用并积聚在细胞表面，然后与GCRV受体结合启动由整联蛋白介导的内吞作用。在感染的中期，GCRV很可能受v-SNARE蛋白的调控并从内体区运输至溶酶体。在阶段，GCRV通过几种不同途径影响细胞膜中类固醇的结构，然后在阶段导致细胞死亡。这些发现拓宽了现有的对GCRV入侵的认识，并可能对制定针对GCRV的疾病战略有帮助。
原文索引：Chen G, He L, Luo L, et al. Transcriptomics Sequencing Provides Insights into Understanding the Mechanism of Grass Carp Reovirus Infection.[J]. International Journal of Molecular Sciences, 2018, 19(2):488.
