2019-12-04
文章题目：Bromodomain inhibitor jq1 induces cell cycle arrest and apoptosis of glioma stem cells through the VEGF/PI3K/AKT signaling pathway
发表期刊：INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY
影响因子：3.571
2019年8月，派森诺生物与吉林大学携手合作，于INTERNATIONAL JOURNAL OF ONCOLOGY杂志上发表了溴结构域抑制剂jq1通过VEGF / PI3K / AKT信号通路抑制神经胶质瘤干细胞的的细胞周期停滞和凋亡的研究成果《Bromodomain inhibitor jq1 induces cell cycle arrest and apoptosis of glioma stem cells through the VEGF/PI3K/AKT signaling pathway》，为胶质母细胞瘤的靶向治疗提供新的依据。
多形胶质母细胞瘤（GBM）是常见的原发性恶性脑肿瘤，尽管近年来出现了多种治疗方法，例如手术，放疗和化学疗法，但胶质母细胞瘤患者的总体生存率并未发生明显变化。胶质瘤干细胞（GSC），具有自我更新的能力和多能性，并且可以诱导肿瘤发生，对神经胶质瘤发展日益重要。因此阐明控制GSC的分子机制可能为开发针对GBM的靶向治疗提供新的信息。而之前的一些研究已经表明，溴结构域和末端外域蛋白，尤其是含溴结构域的蛋白4（Brd4），可能是多种癌症的治疗靶标，但是目前尚不清楚Brd4在多形胶质母细胞瘤（GBM）中的作用和机制。本研究旨在探讨Brd4和溴结构域抑制剂JQ1对神经胶质瘤干细胞（GSC）的抗肿瘤作用的潜在机制。
研究方法：
1、 细胞培养和转染，细胞活力，细胞增殖和自我更新测定，细胞周期分布测定，细胞凋亡测定；
2、 Hoechst 33342染色，免疫荧光，免疫组化实验；
3、 RNA提取，RT-qPCR，蛋白质提取和蛋白质印迹(western blotting)，，RNA-Seq测序和分析
1、Brd4是GBM的潜在治疗靶标
用siRNA处理CSC2078，对Brd4表达进行蛋白质印迹分析（图A和B）；用si-NC或siBrd4（20 µM）感染CSC2078细胞。通过CCK-8测定法检测细胞活力（图C），通过细胞生长计数测定法评估细胞增殖（图D）。通过以上多种实验结果的综合分析，确定Brd4为多形性胶质母细胞瘤的治疗靶标。
2、JQ1抑制GSC的增殖和自我更新
通过细胞计数试剂盒8测定法检测CSC2078和TS543的细胞生存力，结果如下图A和B。通过细胞生长计数测定法评估用JQ1处理后CSC2078和TS543细胞的细胞增殖，如下图C。用JQ1处理10天的CSC2078和TS543细胞的集落形成结果见下图E和F。图G和H测量了用JQ1处理10天的CSC2078和TS543细胞的球形形成能力。这些结果表明，JQ1处理可降低神经胶质瘤干细胞的增殖和自我更新。
3、JQ1和siBrd4通过诱导GSC细胞周期的停滞和凋亡来抑制细胞增殖
图A和C是将CSC2078和TS543用JQ1处理24小时，将CSC2078细胞用si-NC或siBrd4转染48小时后通过流式细胞术分析细胞周期，对CSC2078和TS543的细胞周期定量的结果。图D和F则是将CSC2078和TS543细胞用JQ1处理24小时，用siRNA转染CSC2078细胞48小时后通过流式细胞术分析细胞凋亡，对CSC2078和TS543的细胞凋亡率定量的结果。结果表明，JQ1或siRNA抑制的Brd4会诱导神经胶质瘤干细胞的细胞周期停滞和凋亡。
4、JQ1对Brd4的下调可能会促进GSC分化
RNA‑Seq分析的结果中CSC2078的神经细胞标志物的倍数变化展示在图B中，GO富集分析结果见图A。图C和D是用JQ1处理48 h的CSC1589细胞中干细胞标记物Nestin的免疫荧光分析结果。 图E是用JQ1处理24小时的CSC2078细胞中Nestin表达的qPCR结果。这些结果综合表明，JQ1具有促进神经胶质瘤干细胞分化的潜力。
5、PI3K / AKT信号通路在介导JQ1的抗肿瘤作用中起重要作用。
RNA-Seq中，经JQ1处理后，CSC2078基因上调和下调的基因表达模式的簇热图见图A。JQ1处理与对照后CSC2078上下调的基因数见图B的火山图。图C和F展示了，对照，JQ1处理组和siBrd4组中PI3K，AKT和p-AKT（Ser473）的蛋白质印迹分析表达结果。图G和H则展示了p-AKT（Thr308）在JQ1处理的CSC2078细胞中的Western印迹分析表达结果。最下面的KEGG富集分析气泡图展示了，JQ1处理后，CSC2078的20个显著富集的KEGG途径。这些结果均表明PI3K / AKT信号通路在多形胶质母细胞瘤中起重要作用。
6、JQ1通过VEGF / PI3K / AKT信号通路诱导神经胶质瘤干细胞的周期停滞和凋亡
RNA-Seq结果中CSC2078中与生长因子相关的基因的mRNA表达和JQ1处理后VEGF，MMP9和MMP2表达的蛋白质印迹分析，综合JQ1和或linifanib处理24小时后，细胞周期定量和细胞凋亡率的结果，表明JQ1和siBrd4通过VEGF / PI3K / AKT信号通路诱导GSC的周期停滞和凋亡。
7、JQ1在胶质母细胞瘤肿瘤异种移植模型中具有抗肿瘤活性
对JQ1对胶质母细胞瘤肿瘤异种移植模型的治疗效果进行评估。TUNEL染，H＆E染色和免疫组织化学染色等结果数据综合表明，JQ1可以有效抑制肿瘤发生和GBM的发展。 JQ1的治疗作用可能值得临床试验。
本研究旨在探讨Brd4和溴结构域抑制剂JQ1对神经胶质瘤干细胞（GSC）的抗肿瘤作用的潜在机制。在体外，JQ1和靶向Brd4的小干扰RNA（siBrd4）抑制GSC的增殖和自我更新。在体内，JQ1显著抑制异种移植GSCs肿瘤的生长。RNA-seq分析表明，PI3K-AKT途径在GBM中起重要作用。通过JQ1处理GSC，血管内皮生长因子（VEGF）和VEGF受体2的磷酸化被下调，从而降低PI3K和AKT活性。另外，用JQ1治疗抑制了MMP表达，从而抑制了GBM肿瘤中MMP和血管生成对细胞外基质的降解。对AKT磷酸化的抑制，导致视网膜母细胞瘤/ E2F1复合物表达的抑制，从而使得细胞周期停滞。此外，用siBrd4或JQ1处理可通过激活参与凋亡的AKT下游靶基因来诱导凋亡。总之，这些结果表明Brd4具有作为治疗靶标的巨大潜力，而JQ1对GBM具有显著的抗肿瘤作用，这可能是通过VEGF / PI3K / AKT信号传导途径介导的。
本研究的RNA-seq测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章链接：
https://www.spandidos-publications.com/10.3892/ijo.2019.4863#
