2019-12-10
染色质结构在基因表达调控中起着关键作用。顺式元件的转录因子（TF）结合常与染色质可接近区域有关。因此，在整个基因组中识别这些可接近区域的能力将促进对TF结合、染色质状态和基因表达调控之间关系的理解。转座子可及染色质测序（ATAC-seq）逐渐被应用于绘制动物基因组中开放染色质区，系统性识别动物基因组中的顺式调控区和DNA足迹等。
文章题目: ATAC-Seq analysis reveals a widespread decrease of chromatin accessibility in age-related macular degeneration
发表期刊：Nature Communications
发表年份：2018
影响因子：11.878
技术手段：ATAC-Seq、RNA-seq
老年性黄斑变性（AMD）是60岁以上人群中常见的不可逆视力损害，患者随着全球人口老龄化逐年增加。该病的早期特征会出现玻璃膜疣，视网膜色素上皮（RPE）色素异常，进行性感光功能障碍等。现代医学技术对于占90%AMD病例的萎缩干性AMD，没有任何有效的治疗方法。目前，GWAS分析已经鉴定出至少34个AMD基因风险位点，然而，这些基因变异只解释了AMD病例的一部分。事实上，吸烟和肥胖等变量在AMD发病中也起着非常重要的作用。该研究对较少报道的干性AMD进行全基因组染色质可及性（ATAC-seq）研究，观察与AMD发病和发展相关的染色质可及性情况。
1、对患者和对照组的视网膜和视网膜色素上皮组织进行ATAC-seq；
2、差异开放区域（DARs）富集分析；
3、RNA-seq获取差异表达基因；
4、DARs与差异表达基因的调控网络分析；
5、差异开放区域（DARs）的SNPs分析；
1、视网膜和视网膜色素上皮细胞（RPE）染色质可及性情况
在这项研究中，共获得19个正常、9个早期干性AMD和17个晚期萎缩AMD样本。使用转座可及染色质测序法（ATAC-Seq）来检测基因组染色质可及性。在所有视网膜样本中识别出78795个高置信度开放染色质区域（或峰），在所有RPE样本中识别出49217个峰。视网膜中的染色质可及性总体上高于视网膜色素上皮，这可能反映了视网膜中细胞类型相对于视网膜色素上皮的显示出更高的多样性（图1a）。同时，也揭示了视网膜和RPE共有特有的峰值类别（图1b）。总的来说，视网膜和RPE共有39394个ATAC-Seq峰（42.0%），38625个（41.1%）是视网膜特异性峰，15844个（16.9%）是RPE特异性峰（图1c）。在视网膜和RPE共有的绝大多数峰（81.7%）也存在于其他组织中（图1c）。多维标度计算(MDS)分析表明，视网膜和视网膜色素上皮染色质可及性分组明显（图1d）。此外，大多数AMD样本与正常样本明显分离，尤其是RPE，这表明健康组织与AMD组织在染色质可及性方面存在很大差异。
图1 人视网膜和视网膜色素上皮细胞（RPE）染色质可及性情况
2、AMD患者染色质可及性普遍降低
在比较可及性轮廓时，发现正常和AMD视网膜样本之间的峰值信号存在显著的差异。例如，在视紫红质基因RHO的三个已知调控区中，染色质可及性从正常到早期逐渐降低，然后到晚期AMD（P<0.05，图2a）。通过比较来自黄斑和外周视网膜的健康和AMD样本中每个峰的信号，发现72689个峰（92.3%）降低了AMD患者的染色质可及性（图2b）。排除潜在的遗传和环境差异的影响，从AMD状态不对称的眼睛（图2c）分析，发现与患病程度较轻的眼睛相比，较严重的眼睛黄斑视网膜的大量峰值（76.7%）的强度降低（图2d）。对于双眼处于同一疾病阶段的供体，其黄斑视网膜的染色质可及性轮廓高度对称（图2e）。这项分析证实，染色质可及性的广泛下降与AMD的进展有关。在所有AMD患者RPE样品中，91.6%的峰显示AMD相对于正常样品的强度降低（图3a）。不同阶段AMD患者的RPE中，较严重的左眼（图3b）42860（87.1%）峰值的强度降低。相反，当供体的两只眼睛处于同一疾病阶段时，观察到一个对称分布。综上所述，数据显示AMD患者视网膜和RPE的染色质可及性普遍下降。
图2 AMD视网膜染色质可及性的变化
图3 RPE和不同患病阶段染色质可及性的变化
3、AMD不同阶段染色质可及性降低
将早期AMD的视网膜样本与健康对照组的视网膜样本进行比较时，观察到3个峰值强度在统计学上显著降低（图3d）。然而，通过比较晚期AMD视网膜样本和早期AMD视网膜样本，观察到939个峰值，其强度显著降低，提示视网膜染色质可及性变化主要发生在疾病晚期。相比之下，将早期AMD的RPE样本与健康对照组的RPE样本进行比较时，观察到5458个显著降低的峰，但是当相同的早期样本与晚期AMD的RPE样本进行比较时，只观察到2个显著降低的峰（图3d）。同样，当平均AMD任何阶段显著降低峰值的强度时，发现RPE的染色质可及性在疾病早期阶段明显低于视网膜（图3e）。这一观察结果符合广泛接受的RPE功能改变触发AMD 的理论，并提示RPE细胞的表观遗传改变可能是调节疾病发病的关键因素。
4、AMD与基因调控网络的改变有关
为了确定正常和AMD样本中的差异可及区（DARs）的功能，发现视网膜DARs在基因间区富集，相反，RPE-DARs富集到启动子区域。通过检查转录因子（TF）结合是否在视网膜/RPE中受到影响，观察到22个和13个TF分别在视网膜和RPE-DARs中强烈富集（图4）。此外，OTX2显示晚期AMD与正常样本相比，DARs中的足迹显著减少（图4b，c）。这一模式证实了AMD患者视网膜组织中OTX2靶点的染色质可及性降低，提示视网膜与RPE特异性TFs结合的靶点减少在AMD发病中起着关键作用。
图4 视网膜和视网膜色素上皮细胞中与DARs相关的调控和表达
5、DARs基因在AMD中表达改变
视网膜和RPE中的DAR相关基因对于在每个组织中选择性表达的基因高度富集（图4d）。此外，视网膜中的DAR相关基因更可能调节视网膜层的分层和感光细胞的存活，而RPE中的DAR相关基因更可能调节炎症反应和凋亡，这是AMD的重要生物学过程（图4d）。利用从眼睛间不同AMD阶段患者获得的RNA-Seq数据，观察到ATAC-Seq峰值强度与视网膜和RPE中的基因表达高度相关（图4e）。在不对称AMD阶段的患者中，DAR相关基因在晚期较早期AMD更可能被下调（P=1.1×10-5，图4f）。结果表明，改变视网膜结合部位的染色质可及性和富含色素的TFs导致AMD相关基因的表达减少。
6、与AMD相关基因变异的关系
为了检验所观察到的染色质可及性的变化是否是由AMD相关基因变异引起的，通过GWAS分析比较了DARs与AMD易感性相关基因变异的分布。发现很少的AMD相关的SNP在基因组位置被DARs覆盖。视网膜中有<0.1%的DARs，RPE中有<0.2%的DARs，与AMD相关的SNP重叠（补充图6e）。即使在DARs的每个方向上扩展一个5kb的窗口，DARs与AMD相关SNP重叠的比例仍然很低（视网膜<0.3%，RPE<0.4%）。为了进行比较，检查与AMD相关的SNP重叠的非DARs和非峰的部分，并且发现重叠与视网膜和RPE中DAR区域的重叠相似。这些数据暗示，由于局部AMD相关的遗传变异，观察到的染色质可及性差异不大可能。
7、香烟烟雾对染色质可及性的影响
为了测试吸烟处理的人RPE细胞是否能触发AMD样本染色质可及性的类似变化，对培养的RPE细胞中进行RNA-Seq，证实，iPSC衍生的RPE细胞在基因表达谱上与正常RPE细胞非常相似（R=0.81）。此外，对培养的RPE细胞进行ATAC-Seq，显示出与RPE组织中所有健康样本的平均ATAC-Seq分布大致相似的峰值分布模式（R=0.83）。这些分析都证明了iPSC衍生RPE细胞相对于正常RPE细胞的保真度。将iPSC衍生RPE细胞暴露于香烟烟雾提取物中，并在烟雾处理前后进行ATAC-Seq分析。处理后RPE细胞染色质可及性整体下降（图5b）。更重要的是，当比较吸烟处理过的iPSC衍生RPE细胞和AMD患者RPE细胞时，发现染色质可及性的变化高度相关（图5c；R=0.36，P<10-20）。这些结果表明，在RPE细胞中吸烟会导致染色质可及性的广泛降低，这与AMD中的情况非常相似。
图5 香烟烟雾处理或HDAC11高表达RPE细胞染色质可及性的变化
8、HDAC11过度表达导致染色质可及性降低
通过RNA-seq找到在AMD发展过程中可以引起染色质可及性变化的差异表达基因。在所有组蛋白脱乙酰酶（HDAC）基因中，发现AMD和对照组之间有三个基因（HDAC10、HDAC11、SIRT1）显著差异表达。然而，HDAC11在RPE中的表达在疾病早期显著增加（图5d），并且主要局限于RPE细胞的细胞核（图5e）。并观察到HDAC11高表达细胞的染色质可及性相对于转染空载体的细胞普遍降低（图5f）。HDAC11过度表达引起的变化与AMD患者RPE的变化非常一致（图5g）。这些结果说明HDAC11的过度表达可能是AMD进展中染色质可及性降低的部分原因。
老年性黄斑变性（AMD）是老年人视力下降的重要原因。表观遗传改变在多大程度上调节AMD的进展尚不清楚。该研究使用ATAC-Seq对AMD患者和对照组的视网膜和视网膜色素上皮细胞（RPE）的染色质可及性进行了全局性分析。染色质可及性的整体下降发生在早期AMD的RPE和晚期疾病的视网膜中，这表明RPE的功能障碍导致疾病的发生。光感受器和RPE特异性转录因子的足迹在差异可及区域（DARs）中富集。与DARs相关的基因在AMD中表达改变。吸烟对RPE细胞的处理再现了AMD患者染色质可及性的变化，为AMD的已知危险因素与AMD病理学之间提供了表观遗传学联系。最后，HDAC11的过度表达是导致染色质可及性下降的部分原因，提示HDAC11可能是AMD潜在的新治疗靶点。
