2019-12-27
最近，派森诺生物与新疆农业大学合作，在病毒学专业期刊《Archives of Virology》（影响因子：2.261）发表论文，利用宏病毒组测序技术，探究了新疆一马术俱乐部中，良种母马在持续体重下降后死亡的原因。研究发现了一种新型柯克病毒（Kirkovirus），并通过测序获得了其全基因组信息。
2018年五月，新疆昌吉的一个马术俱乐部中，发生了一起良种马死亡事件，这是一匹2013年从美国引进的良种母马，死亡时正好8岁。事实上，这匹马在2016年怀孕，并产下小马后，就出现了体重不断下降的情况，最后于2018年五月死亡。在没有更多病理学信息，只有粪便样本的情况下，为了找出这匹马死亡的原因，作者利用二代高通量测序技术，对粪便样本中的病毒分布特征进行了研究。
①找出良种马粪便中与其死亡有关的病毒；
②研究对应病毒的全基因组信息；
③调查中国主要产马地区的马体内的病毒组成谱。
研究与良种母马死亡有关的病毒，并调查中国主要产马地区的马体内的病毒组成谱。
测序技术：Illumina HiSeq高通量测序平台
测序模式：宏病毒组测序
实验对象：良种母马的粪便，与其产下的小马驹的粪便
①收集良种母马的粪便，与其产下的小马驹的粪便；
②提取粪便样本中的病毒RNA→反转录→随机扩增，得到PCR产物；
③利用Illumina HiSeq高通量测序平台进行测序和生物信息学分析；
④根据高通量测序得到的目标病毒序列深入研究，得到其全基因组信息，解析该病毒的基因特征；
⑤调查该病毒在中国主要产马地区的马体内的分布情况。
1. 母马及其小马驹粪便中的病毒
研究者从母马及其小马驹粪便的测序结果中，挑选了哺乳动物病毒的序列进行了深入分析，并从中发现了一种与Kirkovirus Equ1病毒的基因序列十分接近的病毒，且这个病毒仅在母马粪便中存在，小马驹的粪便中没有！
而这个Kirkovirus Equ1（KirV Equ1）正好是一种对马的健康状态具有潜在威胁的病毒。KirV Equ1隶属于拟科“Kirkoviridae”，首次发现于美国北部一匹患有特发性肝病的良种马的肝和脾中，它和环病毒科（Circoviridae）的病毒一样，有着一个环形的基因组，不过KirV Equ1的基因组更大，结构更复杂。因其对马的潜在威胁，兽医研究人员对其十分关注。
在本次测序结果中发现的这个与KirV Equ1十分相似的病毒，研究者根据其发现地点与死亡母马的编号，将其暂时命名为“Kirkovirus Cj-7-7”。
2. Kirkovirus Cj-7-7的PCR检测与全基因组图谱构建
测序结果显示，Cj-7-7与KirV Equ1的假定蛋白4基因序列的同源性高达90.17%。随后，研作者以宏病毒组测序结果中拼接得到的Cj-7-7基因序列为模板，设计了针对假定蛋白4（413 nt）的PCR引物，并以小马驹的粪便为阴性对照，对母马的粪便样本做了PCR检测，结果显示母马的粪便中确实能检测到413 nt的目的片段。
随后，作者又以多种PCR引物对Cj-7-7进行扩增，并成功获得了该病毒的整个基因组序列。此病毒的基因组序列全长3738 nt，比KirV Equ1少62 nt，序列相似度为86.7%。整个基因组包括一个开放阅读框（nt 1-918），四个编码假设蛋白的逆向阅读框（nt 3608–3135，nt 3112–2576，nt 2553–1945和nt 1944–1354）。总体而言，Cj-7-7的全基因组图谱与KirV Equ1相似。
图1 Kirkovirus Cj-7-7（A）和KirV Equ1（B）的基因组图谱
3. Kirkovirus Cj-7-7的系统发育分析
图2为将Cj-7-7基因组序列与一些具有代表性的病毒序列进行比对后，建立的基于Rep蛋白基因的最大似然树。系统发育分析表明，Cj-7-7菌株与Equ1亲缘关系密切，与po-circo-like virus 21、22、41、51形成了与拟科Kirkoviridae相应，但与圆环病毒（circoviruses）和环状病毒（cycloviruses）的谱系不同。
图2 利用最大似然法构建的Rep蛋白的系统发育树（黑圈的点为在本研究中发现的病毒）
4. Kirkovirus Cj-7-7的Rep蛋白基因与其它参考菌株的序列一致性
如表1所示，在KirV Cj-7-7中鉴定出的Rep基因与KirV Equ1的核苷酸序列相似度（91.5%）和氨基酸序列相似度（88.2%）最高，其次是4种po-circo-like病毒，核苷酸和氨基酸序列同源性分别为51.4-58.1%和37.2-46.9%。此外，KirV Cj-7-7的Rep基因与包括圆环病毒和环状病毒在内的其余非近缘病毒核苷酸和氨基酸序列一致性均很低。
Kirkovirus Cj-7-7的Rep蛋白基因与其他参比菌株的序列一致性
5. Kirkovirus Cj-7-7的流行病学调查
流行病学调查显示，来自同一马术俱乐部的20匹良种马的粪便样本中，有12份在KirV Cj-7-7检测中呈阳性反应，这表明，该病毒正在良种马中传播，不过，Cj-7-7基因在86匹良种马的血清和91匹良种马的鼻拭子中均未被PCR检测到，这表明Cj-7-7对肠道细胞具有亲和性。
研究者还在取自伊宁市30匹伊犁马的7份粪便样本、取自乌鲁木齐市11匹亚洲野马的2份粪便样本中发现了KirV Cj-7-7。且PCR分析显示阳性样本的病毒之间没有遗传差异，这表明新疆北部健康的马匹可能携带了Cj-7-7病毒。
本研究利用宏病毒组测序，在探究新疆一马术俱乐部中，良种母马在持续体重下降后死亡的原因的研究过程中，发现了一种新型柯克病毒（Kirkovirus），并通过测序获得了其全基因组信息，且有以下发现：
①在死亡母马粪便中发现的KirV Cj-7-7与Kirkovirus Equ1（KirV Equ1）密切相关，应该隶属于Kirkoviridae拟科；
②Kirkoviruses具有多样化的特征，且具有地域分布特征，健康马匹可能携带该病毒。
本研究为中国主要产马地区的马体内KirV Cj-7-7的传播提供了重要的分子证据。虽然目前的结果还不足以证明该病毒是导致母马死亡的原因，但确实表明Kirkoviruses具有多样化的特征且能在健康马匹中检出。
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
Xie J, Tong P, Zhang A, et al. First detection and genetic characterization of a novel kirkovirus from a dead thoroughbred mare in northern Xinjiang, China, in 2018[J]. Archives of Virology, 2019: 1-4.
https://link.springer.com/article/10.1007%2Fs00705-019-04487-4
