2020-03-27
发表期刊：Journal of Functional Foods
影响因子：3.197
文章题目：Indirectly stimulation of DCs by Ganoderma atrum polysaccharide in intestinal-like Caco-2/DCs co-culture model based on RNA-seq
技术手段：RNA-seq、qPCR、Elisa、western blot
派森诺生物与南昌大学携手合作，于2020年2月在《Journal of Functional Foods》上发表了灵芝多糖对肠样Caco-2/DCs共培养模型树突状细胞的间接刺激作用的研究成果。
灵芝多糖（PSG-1）是一种高纯度的蛋白结合多糖，含有10.1%的蛋白质和17种氨基酸，大量的研究表明PSG-1对多种免疫细胞的免疫调节活性有影响，直接接触T淋巴细胞并刺激表面受体。然而，PSG-1作为一种大分子多糖，到达肠道后首先与肠上皮细胞（IECs）接触，并不能直接刺激免疫细胞。树突状细胞（DC）作为有效的抗原呈递细胞，具有强大的刺激初始免疫反应的能力，成熟的DCs可以表达多种共刺激分子，同时合成和分泌肿瘤坏死因子（TNF）-α和白细胞介素（IL）-1等多种细胞因子，诱导和调节免疫应答。近年来，许多研究表明，从食品和中药中分离的天然多糖能够诱导DCs成熟。为了更好地模拟肠道微环境，了解肠道上皮细胞与其内部免疫细胞之间的相互作用，该研究建立了Caco-2/DCs共培养模型。利用RNA-seq对PSG-1刺激的DCs共培养模型中的所有转录本进行整体筛选，在此基础上进一步研究了PSG-1对DCs免疫功能的影响及其可能的分子机制。
RNA-seq、qPCR、Elisa、western blot
1、利用illumina平台对PSG-1刺激的DCs的所有转录本进行整体筛选。生物信息学分析发现了PSG-1组与对照组共有2293个差异表达基因，其中上调基因1180个，下调基因1113个如火山图所示。PCA主成分分析和表达量热图可以看出PSG-1对样本表达量的影响是非常明显的。
图1 mRNA表达谱和差异基因火山图
2、根据获得的DEGs，进行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集的结果表明，在生物过程的前10个显著富集GO项中，与免疫相关的GO项所占比例较大，如“免疫系统过程”、“防御反应”和“免疫系统过程的正调控”，表明PSG-1在Caco-2/DCs共培养模型中仍对DCs的免疫功能产生影响。
图2 差异表达基因的GO富集分析
3、通过对DEGs进行KEGG信号途径分析，共鉴定出109条显著富集途径。为了探讨PSG-1在Caco-2/DCs共培养模型中是否能通过与Caco-2的直接接触激活Caco-2与DCs之间的“对话”，最终影响树突状细胞的免疫功能。因此，与“环境信息处理”相关的显著富集途径中的3个途径被进一步研究：“细胞因子-细胞因子-受体相互作用”、“NF-κB 信号通路”和“MAPK信号通路”。
图3 显著性前20个的KEGG富集途径气泡图
图4 NF-κB途径的热图和KO图
图5 MAPK途径的热图和KO图
4、随机选取15个与MAPK途径和NF-κB途径相关的DEGs，验证RNA-seq结果，比较RT-qPCR和RNA-seq分别检测的基因表达情况，从图6中可以看出PSG-1间接作用后DCs的mRNA表达上调或下调趋势一致。
图6 qPCR验证RNA-seq
5、采用ELISA法对DCs周围培养液中典型细胞因子水平进行了定量分析，来验证PSG-1在翻译水平上对DCs分泌细胞因子的影响。如图7所示，PSG-1可促进DCs细胞产生细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、RANTES、MIP-1α和MCP-1，除MCP-1外，上述细胞因子均呈剂量依赖性增加。上述细胞因子在转录和翻译水平上的升高说明PSG-1增加了肠样Caco-2/DCs共培养模型DCs上炎症介质和趋化因子的表达，进而影响其免疫功能。
图7 DCs共培养模型中用PSG-1刺激产生细胞因子和趋化因子的水平
6、采用western blot法检测了间接暴露于PSG-1（40、80和160μg/mL）24小时后DCs中与NF-κB途径和MAPK途径相关的关键蛋白的表达。如图8所示，PSG-1显著促进肠内Caco-2/DCs共培养模型中p-IκBα和p-p65的水平，表明PSG-1对NF-κB信号通路的激活是其对肠样Caco-2/DCs共培养模型DCs免疫促进作用的基础。同样，与对照组相比，ERK1/2、JNK和p38的磷酸化被激活，并且其作用呈剂量依赖性。说明PSG-1通过MAPK信号通路对DCs仍有稳定的免疫促进作用。
图8 PSG-1间接刺激DCs的NF-κB和MAPK途径关键蛋白质的免疫印迹带和相对强度
综上所述，该研究利用RNA-seq进行了DEGs、GO和KEGG分析，阐明PSG-1在肠样Caco-2/DCs共培养模型中间接诱导DCs的免疫应答和免疫功能，其中NF-κB和MAPK信号通路起重要作用。揭示了PSG-1可促进DCs的成熟，调节DCs在肠道内的免疫反应，是诱导机体主动免疫、维持肠道稳态、最终提高机体免疫力的关键。
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
原文索引：
Indirectly stimulation of DCs by Ganoderma atrum polysaccharide in intestinal-like Caco-2/DCs co-culture model based on RNA-seq.[J]. Journal of Functional Foods.2020,67.
文章链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1756464620300748?via%3Dihub
