2020-05-13
发表期刊：International journal of molecular sciences
影响因子：4.183
文章题目：Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle
技术手段：RNA-seq
派森诺生物与上海交通大学孟和教授课题组携手合作，于2020年4月8日在《International journal of molecular sciences》上发表了通过转录组学方法研究MSTN敲除对鸡骨骼肌的影响的研究成果。
骨骼肌的生长发育与家禽的产量密切相关，了解鸡肌肉生长发育的调控机制可以优化肉的生产效率，已经有研究确定了一些参与肌肉生长和发育调节的关键基因（例如MSTN，IGF1）。一些研究人员已经获得MSTN敲除(KO)山羊，并探索了这些山羊的转录组特征，以研究MSTN KO对肌肉的影响。在鸡中利用MSTN基因编辑研究肌肉生长发育的分子机制的研究较少。CRISPR已经在小鼠中被用于基因编辑以研究基因功能，但在鸡肌肉中的应用较少，鸡的一种可行方法是产后基因编辑，这也可以探索基因功能和基因治疗。为了验证是否可以在雏鸡的肌肉中完成产后基因编辑并确定转录组的变化，作者在雏鸡中敲除了MSTN并对敲除的KO肌肉和WT肌肉进行了转录组分析。
CRISPR/Cas9，RNA-Seq
1、雏鸡肌肉中MSTN的敲除(KO)
实验首先设计了针对鸡的MSTN外显子1和外显子3的单一向导RNA (sgRNA)序列，随后使用腺病毒(AdV)载体共表达SpCas9和这对sgRNAs(图1A)。图1B显示了利用CRISPR/ cas9介导的非同源末端连接(NHEJ)在鸡基因组中产生5093 bp缺失，cDNA缺失728 bp，通过实验验证了AdV-CRISPR体系在鸡细胞中MSTN基因的编辑功能。实验将AdV-CRISPR转入雏鸡胫前肌，分别收集3日龄(3d)和14日龄(14d)雏鸡的肌肉组织（图1C）。实验结果证实所有转染AdV-CRISPR的肌肉均为缺失突变体，mRNA中缺失的核苷酸数量从736个到783个不等(图1D)。
图1敲除(KO) MSTN的肌肉的制备与验证
2、KO肌肉中差异表达基因(DEGs)
本研究通过转录组测序检测KO肌肉和WT肌肉的mRNA表达谱。通过比较3d KO vs 3d WT和14d KO vs 14d WT，分析MSTN KO肌肉转录组的差异。与WT组相比，3d和14d 的KO组MSTN表达下调，14d时差异显著(p-value < 0.001)(图2C)。通路分析(IPA)显示了在3d KO vs 3d WT中有14个与MSTN相互作用的因子，在14d KO vs 14d WT中有3个互作因子(图2D)。 FMOD、MMP9、Tnf (家族)是与MSTN互作的常见分子。IPA显示许多差异表达基因与骨骼肌组织发育相关。有5个差异表达基因，包括MMP9、EOMES和Ex-FABP，均在两组比较中被发现。差异基因聚类显示了这些与骨骼肌组织发育相关的基因的表达谱(图2E,F)。
图2 MSTN表达差异，差异基因火山图和聚类热图
3、差异基因功能富集分析
根据获得的DEGs，进行GO富集分析和KEGG富集分析。GO富集的结果表明，在生物过程的前6个显著富集GO项中，两个比较组的差异基因显著富集在细胞分化和增殖、肌肉生长和发育、能量代谢、凋亡过程、免疫系统和信号转导 (图3A)。通过比对14d KO vs 14d WT的基因，实验发现MSTN参与的GO terms，包括对胰岛素受体信号通路的负调控，对凋亡过程的调控，以及对细胞因子活性的影响。
通过比较3d和14d的KO和WT骨骼肌，相关的分子和细胞功能包括：细胞发育，细胞生长和增殖，细胞功能和维持，细胞间信号和相互作用，以及细胞运动。在3d KO vs 3d WT组和14d KO vs 14d WT两个比较组共有的富集的15条通路中，与肌肉生长相关通路为：PDGF信号通路和STAT3信号通路。PDGF信号通路与快速生长和更大的肌肉质量有关，而STAT3信号通路是成肌细胞增殖的关键介质。PA分析发现了一个14d KO vs 14d WT组中的重要基因网络，并涉及到MSTN。该网络与骨骼和肌肉疾病、神经系统疾病以及机体损伤和异常有关(图3B)。
图 3 差异表达基因的GO富集和KEGG富集分析
本研究在所有KO肌肉中均实现了MSTN的大片段缺失（> 5 kb），以及在第14天，MSTN基因表达明显下调。转录组结果显示差异表达基因（DEGs）与细胞分化和增殖，肌肉生长和能量代谢有关。该方法为雏鸡进行产后基因编辑提供了一种潜在方法，本实验结果也为进一步研究肌肉生长发育的机制提供了基础。
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
原文索引：
Xu K, Han CX, Zhou H, et al. (2020) Effective MSTN Gene Knockout by AdV-Delivered CRISPR/Cas9 in Postnatal Chick Leg Muscle. International journal of molecular sciences 21(7), 2584.
文章链接：
https://www.mdpi.com/1422-0067/21/7/2584
