2020-06-01
发表期刊：Environmental Pollution
影响因子：5.7
文章题目：Biochemical and genetic basis of cadmium biosorption by Enterobacter ludwigii LY6, isolated from industrial contaminated soil
技术手段：SEM、XRD、EDS、RNA-Seq
派森诺生物与四川农业科学院携手合作，于2020年4月在《Environmental Pollution》上发表了细菌吸附镉的生化及遗传基础相关研究。
我国部分耕地受到严重的重金属污染，不仅造成蔬菜粮食减产，更威胁食品安全。镉是目前严重的环境污染物之一，过量摄入镉可影响人的泌尿系统、神经系统和骨骼发育，而目前临床上尚无治疗镉中毒的有效药物。
因此，国内外专家正在积极寻找有效的策略来控制重金属污染向食物链的转移。种种措施中，微生物吸附剂似乎是有前途的安全农业措施之一。已有研究证明，多种细菌可表现出良好的耐镉能力，它们主要通过细胞外吸附和细胞内摄取来实现重金属的生物稳定。
本研究从土壤中分离到一株耐镉细菌——Enterobacter ludwigii LY6，首先对其进行镉吸附效率评估，然后分析该细菌在不同镉浓度处理下的形态变化和析出物组分，最后利用转录组学方法揭示LY6响应镉胁迫的潜在分子机制。
1、 LY6菌株的分离和鉴定
该菌是从是从四川德阳什邡磷矿厂周边土壤中分离得到的，基于基因测序结果和系统发育分析(图1)，最终被鉴定为肠杆菌属ludwigii LY6。
图1 基于16S rRNA序列的LY6菌株系统发育分析
2、 镉去除效率
在0 mg/L、1 mg/L、10 mg/L和100mg/L的镉浓度下培养LY6，48h后测定液体培养基的pH值，采用石墨炉原子吸收光谱法测定细菌表面和内部液体介质中的镉浓度。结果显示，在1 mg/L和10 mg/L的镉浓度下，LY6菌株的镉去除率分别为39.3%和38.9%，而当镉浓度提升至在100 mg/L时，LY6的镉去除率明显提高，达到56.0%（表1）。
表1 不同镉浓度处理下LY6菌株的生长情况和镉去除效率
3、 沉淀物分析
收集不同浓度镉培养的菌株，用扫描电镜观察菌株的表面形貌。结果表明，在0 mg/L、1 mg/L和10 mg/L的镉浓度下，菌株的表面形态无明显变化。然而,在100 mg/L镉培养时,细菌表面形成许多48-60纳米大小的颗粒(图2)。此时，细菌和纳米颗粒表面在液体培养基中形成了黄色沉淀。进一步利用XRD和EDS对这些黄色沉淀分析发现，其化学成分为硫化镉（图3）。
图2 不同浓度氯化镉(mg/L)处理菌株LY6的扫描电镜(SEM)形态学观察
图3 不同浓度氯化镉培养LY6后收集沉淀物的元素组成分析
4、 转录组测序分析
从上述结论已知，大部分的氯化镉可被LY6表面的胞外多糖吸收，但仍有部分镉进入细胞，其必影响细菌的基因表达。因此对0 mg/L、1 mg/L和10 mg/L镉浓度培养下的LY6进行转录组测序，并进行差异基因分析和功能富集分析。
4.1随着镉浓度增加而上调表达的基因
差异基因中，有106个基因的表达量随镉浓度的增加而增加(图4)，其中包括多重耐药蛋白marA和marR、氮同化调节蛋白nac、冷休克蛋白CspA、胸苷合成酶（thymidylate synthase）和渗透压反应调节剂（osmolarity response regulator）。以marA为例，该基因被报道可激活DNA修复和脂质转运所需基因的表达，从而增强肠道细菌的抗生素耐药性。该分析结果说明以上基因在LY6对镉胁迫的反应中发挥关键性的作用。
图4 热图展示50个随着镉浓度增加而上调表达的基因
4.2、随着镉浓度增加而下调表达的基因
差异基因中，有73个基因的表达量随镉浓度的增加而降低（图5）。与不含镉的对照相比，镉处理的样品中，转录调节蛋白BolA、DnaK抑制蛋白、脱氧核糖体磷酸酶、多磷酸化转移蛋白和硝酸还原酶相关的基因显著下调。有趣的是，在镉胁迫下，与能量代谢相关的基因：细胞色素o泛素氧化酶亚基3（cytochrome o ubiquinol oxidase subunit 3），也显著下调。该基因可编码细菌细胞的主要呼吸蛋白，其下调表达使细菌产生更少的活性氧(ROS)，从而保护细菌免受极端氧化损伤。
图5 热图展示50个随着镉浓度增加而下调表达的基因
4.3、随着镉浓度增加，上下调规律发生变化的基因
差异基因中，11个基因，包括蛋白YpeC、伴侣蛋白ClpB和磷酸乙醇胺转移酶ybiP，在低镉浓度（1 mg/L）下显著下调，但在较高的镉浓度（≥10 mg/L）下，它们的表达水平较CK显著升高(图6)。相比之下，15个基因在低镉浓度（1 mg/L）下显著上调，而在高镉浓度（≥10 mg/L）下显著下调（图6）。该结果提示不同浓度重金属胁迫下，LY6可能具有不同的调控应对机制。
图6 热图展示50个随着镉浓度增加，上下调规律发生变化的基因
4.4、功能富集分析
GO富集分析显示（表2），当低镉浓度（1 mg/L）处理时，差异基因的富集结果中没有显著的GO条目。当高镉浓度处理（≥10 mg/L）时，分子功能中，差异基因多富集于“细胞色素c氧化酶活性”、“血红素-铜末端氧化酶活性”、“氧化还原酶活性”条目；细胞组分中，差异基因多富集于“呼吸链”条目，生物过程中，差异基因多富集于“离子跨膜运输”、“质子运输”和“氢运输”条目。说明氧化还原活性、呼吸链和转运功能在LY6应对重金属胁迫的响应中起重要作用。
表2 大于10 mg/L镉浓度培养的LY6与对照组LY6的差异基因GO富集分析结果
KEGG富集分析显示（表3），低镉浓度（1mg/L）处理时，差异基因显著富集于“果糖和甘露糖代谢”、“己内酰胺降解”、“柠檬烯和蒎烯降解”和“香叶醇降解”通路；而高镉浓度（≥10 mg/L）处理时，差异基因显著富集于与“烟酸和烟酰胺代谢”和“萜烯类中枢生物合成”相关的代谢途径，以及与“细菌趋化”相关的细胞过程途径。
表3 不同处理LY6的差异基因KEGG富集分析结果
本研究从磷矿厂周围土壤分离得到一株耐镉细菌——Enterobacter ludwigii LY6，它的镉去除效率可达56%（100mg/L镉处理下）。通过物理方法研究发现，LY6菌株可通过胞外多糖吸附镉，并可在菌体表面生成硫化镉纳米颗粒。
转录组测序结果显示，LY6在不同浓度下对重金属胁迫具有不同的调控机制。氧化还原活性、呼吸链和转运功能等GO功能，以及细菌趋化和萜烯类生物合成等KEGG通路与细菌的镉耐受性和生物吸附密切相关。
本研究发现的耐镉相关基因为耐镉菌株的遗传育种奠定了基础。
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
