2020-06-16
期刊：《Journal of Hazardous Materials》
影响因子：7.650
近日，派森诺生物与东北农业大学资源与环境学院携手，在微生物基因组领域的《Journal of Hazardous Materials》发表研究成果！
研究背景
腈类是一类具有广泛用途的剧毒化学药品，这些化合物会对人类和生态系统构成潜在威胁。生物、物理、化学的方法可以用来消除腈类化合物，其中生物法因其温和、经济等特点，已被证明是一种较好的方法，受到了广泛的关注。本研究的目的是探索能够降解脂肪族腈的紫红红球菌BX2（Rhodococcus rhodochrous BX2）的生长特性、相关酶的生物学活性、基因组功能以及代谢途径等，以期增进我们对脂肪族腈类化合物的认识，为红球菌属在生物修复和降解酶资源开发中的潜在应用提供新的前景。
研究材料和方法
图1. 试验设计
采用Illumina MiSeq和PacBio测序平台，对BX2进行基因组特征和比较基因组学分析，了解并揭示BX2是如何有效地消除脂肪族腈并适应恶劣环境的。
研究结果
1、脂肪族腈的矿化
矿化作用是反映污染物完全降解的一个特别重要的指标，是潜在生物修复应用的基础。本文以总有机碳(TOC)分析为基础来评估有机物矿化作用效率，研究了BX2对脂肪族腈化生物矿化作用，腈化物的去除和碳化作用随着时间变化的趋势见图2。BX2菌株的高矿化能力使其成为腈污染环境的实际生物修复的重要候选菌株。
图2. 液体环境中脂肪腈的降解和矿化作用
2、BX2全基因组特性分析及适应腈污染环境分析
对BX2菌株进行高通量测序，拼接组装得到1条染色体，3个质粒（图3A）。基因组注释分析发现，所有碳水化合物的中心代谢途径(糖酵解、戊糖磷酸途径和柠檬酸循环)均存在，在BX2基因组中，发现了编码腈代谢的末端代谢物转移到中枢代谢中的基因，表明BX2具有脂族腈降解和代谢的完整途径。该结果为BX2矿化腈类化合物提供了遗传基础。
一般来说，氮源是受氮污染环境中丰富常见的化合物，被认为对微生物的生存至关重要。BX2拥有广泛的编码氮代谢相关蛋白的基因。在基因组中发现了特异性Amt型转运蛋白(chr_orf02879)和谷氨酸脱氢酶(chr_orf02339等)或谷氨酰胺合成酶(chr_orf00120-chr_orf10021)-谷氨酸合成酶途径(GS-GOGAT途径)，这些基因参与了氨的同化。在营养元素缺乏和外来生物污染物丰富的氮污染环境中，BX2中转运体系统的丰度可能对该生物的生存很重要。
水平基因转移(HGT) 是不同于垂直基因转移的遗传物质的交流方式。在污染环境这一特异生态环境中，降解基因的水平转移有着特殊的功能与作用。在转座酶和整合酶的辅助下，BX2发生了许多水平基因转移事件。对BX2进行预测后，发现其染色体以及质粒1、2、3含有的基因岛个数分别是68、8、3和1个。这些基因岛中所有已鉴定的基因包括辅助蛋白相关基因、苯甲酸酯等降解相关基因和各种转录调节因子。
图3.（A）BX2基因组圈图；（B）BX2基因组中预测到的基因岛图
3、在BX2中腈降解的遗传基础
从注释结果来看，BX2具有很多腈分解代谢系统，这与该菌株几乎只在脂肪族腈上有效生长一致。在BX2的质粒上发现了一个腈水合酶/酰胺酶基因簇和一个腈酶基因簇（图4），腈水合酶/酰胺酶基因簇的大小为6114bp，由7个排列在一起的基因组成；腈酶基因簇的大小为2061bp，由2个基因排列在一起。在BX2中编码腈降解的基因簇序列和组织是重要的信息，将有助于阐明腈降解基因的遗传多样性。
图4.腈降解基因簇在BX2上的排列
4、比较基因组分析
图5. (A)BX2基于16S rDNA序列的进化树;(B)共线性分析
截至到2018年4月26日，红球菌属已测序的菌株有28个。28株分析菌株是从土壤、海水、病树和污水处理厂等不同来源分离得到的，表明红球菌菌株具有很高的抗病性，能够适应多种自然环境。通过系统发育树分析(图5A)和共线分析(图5B)，将菌株BX2划分为玫瑰色红球菌。在19个测序的菌株中发现了一个或多个质粒，菌株BX2有3个质粒。众所周知，质粒在特定环境中生长是必不可少的，质粒携带着污染物降解、毒力、耐药性等基因。结合全基因组测序结果表明， BX2可以更有效地降解丁腈化合物，并能适应多种生态环境。
5、腈降解酶的诱导性或组成性以及脂肪腈生物降解的主要途径
图6. (a-1)、(a-2)和(a-3)分别表示以乙腈、丙烯腈和丁腈为底物的腈降解酶的分布;
(a-4)表示脂肪族腈在胞内酶、细胞周质酶和胞外酶对脂肪族腈的降解
酶定位分析表明，负责降解脂肪族腈的酶主要存在于细胞中（图6），且是可以被诱导产生的。为了进一步证实BX2中腈转化酶的性质，我们考察了添加第二碳源(葡萄糖)对脂肪族腈的降解和细菌生长的影响。当脂肪族腈作为碳的唯一来源加入MS培养基时，这些化合物被高度降解（图7a、b、c）。但当MS培养基中同时存在脂肪族腈和葡萄糖时，菌株BX2表现出明显的生长特性，在初始阶段不能降解脂肪族腈(这种现象称为双增长)，这可能是由于菌株表现出碳分解物抑制（CCR）造成的。结果证明适当浓度的葡萄糖可以诱导CCR，并且腈降解酶是可诱导的。
图7.(a)、(b)和(c)分别表示在存在或不存在乙腈、丙烯腈和丁腈的情况下，添加不同浓度糖的MS培养基中菌株BX2的生长、腈的降解和葡萄糖的降解情况.
脂肪族腈降解的腈水合酶mRNA水平随着时间增加而升高，在孵育6h、8h和36h时达到峰值，然后下降；酰胺酶mRNA水平表现出相似的趋势（图8）。随着培养时间的延长，氮降解酶mRNA水平逐渐升高，分别在培养24h、36h和60h达到峰值，随后下降。结果表明，外部碳源显著提高了氮降解酶的mRNA水平，尤其是腈降解酶的mRNA水平。腈降解酶活性与mRNA在腈降解过程中的表达趋势相似。结果表明，含葡萄糖的矿物培养基在细胞呈指数增长时表现出较强的CCR响应，使某些碳源优先被吸收，从而促进菌株BX2的生长和腈降解酶的表达。与此同时，介导CCR的分解代谢物控制蛋白CcpA在BX2菌株的基因组中被检测到。
图8. (a-1)、(b-1)、(c-1)分别表示三种腈类降解酶对乙腈、丙烯腈和丁腈降解的mRNA水平；
(a-2)、(b-2)、(c-2)表示三种腈类降解酶对乙腈、丙烯腈和丁腈(含葡萄糖)降解的mRNA水平；
(a-3)、(b-3)、(c-3)表示乙腈、丙烯腈和丁腈在BX2中降解腈的酶活性；
(a-4)、(b-4)、(c-4)表示乙腈、丙烯腈和丁腈(含葡萄糖)在BX2中降解腈的酶活性
前期研究中推测腈水合酶/酰胺酶和腈酶系统都参与了BX2中的脂肪族腈的降解，并且前者是主要的降解途径。为了进一步验证这一推断，使用腈水合酶抑制剂和腈酶抑制剂进行实验。如图9可得，两种抑制剂的添加对菌株BX2的细胞生长和脂肪族腈降解均有负面影响，并且腈水合酶抑制剂比腈酶抑制剂表现出更大的抑制作用。这些结果表明腈代谢酶都参与了腈的生物降解，其中腈水合酶/酰胺酶系统在脂肪族腈的降解过程中起着至关重要的作用。
图9.不同酶抑制剂对细胞生长和腈降解的影响.
研究结论
1、BX2可以矿化三种脂肪类腈；
2、BX2基因组中发现与碳源和氮源代谢、胁迫感应与应答、信号转导以及水平转移相关的基因，基因组分析得到了两个腈类降解相关的基因簇；
3、BX2中发现CcpA基因，该在碳代谢阻遏中起关键作用，其详细功能仍需进一步研究。
4、腈降解酶诱导性的确定为腈的生物转化奠定了基础。
5、细胞内诱导的腈水合酶/酰胺酶和腈水解酶均参与了脂肪族腈的生物降解，而前者是重要途径。
本文的研究有力地表明了菌株BX2在与腈类化合物相关环境污染的生物修复和降解酶资源开发方面的潜在应用。
本研究的denovo测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引：An X, Cheng Y, Miao L, Chen X, Zang H, Li C. Characterization and genome functional analysis of an efficient nitrile-degrading bacterium, Rhodococcus rhodochrous BX2, to lay the foundation for potential bioaugmentation for remediation of nitrile-contaminated environments. J Hazard Mater. 2020;389:121906.
