2020-07-20
期刊：Clinical Infectious Diseases
影响因子：9.055
近日，派森诺生物与华中农业大学动科动医学院陈焕春院士团队王湘如老师合作，在传染病领域权威期刊Clinical Infectious Diseases在线发表了题为“A novel human acute encephalitis caused by pseudorabies virus variant strain”的研究论文。
研究背景
伪狂犬病毒(Pseudorabies virus, PRV)属于疱疹病毒(Alpha herpesvirinae)，宿主广泛，猪是其天然宿主。被PRV感染的母猪表现出生殖衰竭，新生猪表现出致命性脑炎，死亡率100％，生长肥育的猪表现出呼吸窘迫和生长障碍，其他易感动物也通常以死亡告终。自1914年以来，根据临床症状，动物接触史或检测到的抗体，偶有争议的人类PRV感染病例。2017年以来，基于患者组织样本的二代测序结果，中国又陆续报道了13例临床诊断为人感染PRV的病例，但在上述所有病例报道中，均未成功分离出PRV。
在本研究中，报道了4例由伪狂犬病病毒（PRV）感染引起的人急性脑炎病例，总结了PRV感染人的临床特征，并首次从患者脑脊液中分离得到一株PRV hSD-1/2019。此外，本研究还对该PRV分离株hSD-1/2019进行了病因学和遗传特征研究，该毒株的生物学特性表现与当前我国猪群中流行的PRV变异毒株相似。该研究首次为PRV向人群的跨种传播提供了直接有力的病毒分离证据。
研究材料和方法
临床病例调查
获得4例患者的血液、血清和脑脊液标本，用于常规临床和实验室诊断。
病毒分离和病原学鉴定
采集患者脑脊液进行病毒分离。通过PCR扩增PRV的gB和gE基因，透射电镜(TEM)和间接免疫荧光检测(IFA)确认病毒的存在。
从感染细胞裂解液中提取hSD-1/2019和HuBXY/2018的基因组DNA，并利用二代BGI平台和三代PacBio平台进行测序，由上海派森诺生物科技有限公司完成。收集NCBI中所有具有基因组序列的PRV菌株作为参考，基于基因组的完整编码序列(CDS)区域和gC基因分别构建系统发育树。
进行中和试验以检查PRV毒株的免疫原性。测定PRV菌株的斑块大小，并在MDBK细胞中进行比较。
研究hSD-1/2019和HuBXY/2018在小鼠和猪体内的致病性。记录每日直肠温度和临床体征，并使用gE特异性TaqMan qPCR检测组织中的病毒。
伦理知情同意和参与
患者的所有治疗均经河南省人民医院伦理委员会授权。
统计分析
数据以三种独立检测方法的均值±标准误差(mean±SEM)表示。使用GraphPad Prism(version 6.0, La Jolla, CA, USA)进行统计分析。
研究结果
4例人类急性脑炎诊断为PRV感染
在本研究中，研究团队总结了4例人类急性脑炎病例的流行病学和临床特征。这4名患者的接触史显示，人类主要通过血液或粘膜接触受感染的猪或受污染的物质，具有显著的感染风险。患者在疑似伤口暴露后的7天内出现“流感样”的症状，病程发展较快，从最初的发烧发展为神经系统症状（如癫痫发作）仅需1-5天。与病例1和病例4相比，合并呼吸衰竭的病例2和病例3出现更严重的肺炎，表现为多灶性散乱空域混浊、支气管周围实变为主区域和胸腔积液。
MRI显示4例脑炎患者具有相似的脑部病变累及区域，其中病例1和病例3的视网膜MRI结果显示分层效应，提示视网膜脱离。与那些易感动物而不是猪的确切死亡结果不同，人类在感染后接受足够的抗病毒治疗可以存活，但一些患者会出现严重的神经后遗症。
为了进一步揭示PRV感染人的病例特征，研究人员以病例1为代表，通过动态监测病毒gB拷贝数和PRV特异性抗体，展示其病因学和血清学变化。研究结果发现gB抗体的血清转化时间明显早于gE抗体，且在转化后均持续保持阳性；血清中和抗体出现了超过4倍的滴度变化。ddPCR的结果显示，在不同的取样日期，在血液、脑脊液和咽喉拭子中均检测到病毒DNA，在第8天到第15天在血液中检测到高水平的病毒DNA，这与白细胞减少的持续时间相符，在第8天进行抗病毒治疗，有效地减少了血液中的病毒拷贝。值得注意的是，在晚期咽喉拭子中经常检测到大量的gB拷贝，提示咽喉可能是人类PRV复制和脱落的靶器官。
从患者中成功分离出PRV hSD-1/2019
研究人员首次成功从患者的脑脊液样品中分离得到PRV毒株hSD-1/2019，并对其进行了电镜观察、免疫荧光分析以及全基因组测序分析
系统发育分析
将组装好的hSD-1/2019和HuBXY/2018 (GenBank 登录号分别为MT468550和MT468549)基因组DNA进行系统发育分析。基于全基因组和gC基因的系统发育分析均表明该hSD-1/2019毒株属于基因II型，来自中国的PRV分离株位于一个单独的系统发育分支上，与其他国家的分离株不同。在该分支中，hSD-1/2019与PRV变异株HNX和HN1201相邻，而与Fa、Ea和SC等菌株亲缘关系较远。
免疫原性分析
研究团队进行交叉中和试验以确定hSD-1/2019的免疫原性。结果显hSD-1/2019与PRV变异株具有相似的免疫原性，但与毒株Ea不同。该研究测试了4名患者血清对hSD-1/2019和Ea的中和能力，所有患者的血清对hSD-1/2019的中和效价均高于对Ea的中和效价，进一步支持了从免疫原性角度看，hSD-1/2019菌株可能导致人类感染。
hSD-1/2019体外增殖特性研究
通过空斑实验、增殖曲线和CPE观察，评价hSD-1/2019在多个细胞系中的增殖特性，这些观察结果表明hSD-1/2019是PRV变异株，表现与PRV常规株不同。
hSD-1/2019的体内致病性
研究团队通过在小鼠中检测LD50来研究hSD-1/2019和其他PRV毒株的致病性。考虑到患者的接触史，还在猪身上测试了其致病性。结果表明hSD-1/2019可感染小鼠和猪，并表现出较高的致病性。
讨论
该研究较为系统地跟踪研究并总结了人感染PRV导致急性脑炎的临床病例特征，根据人源PRV株hSD-1/2019的病原学特征和系统发育关系，首次分离并鉴定为中国变异株，为PRV的跨种感染研究提供了新的病原学证据和基础。这种“威胁生命的新的人畜共患病”值得更多关注，人类PRV感染的机制需要进一步研究。
据报道，PRV gD可结合人和猪具有相似亲和力的nectin-1蛋白，启动病毒进入，这在很大程度上支持了PRV在人类感染的可能性。人类和动物之间没有坚不可破的界限和物种隔离。例如，2003年的非典由果子狸携带SARS冠状病毒感染人，还有发生在今年的新冠肺炎全球大流行。
近几年发生的PRV感染事件也许正在警告我们这种跨物种传播的可能性，无非是时间问题。病毒学家必须加强研究才能揭开病毒跨物种传播的面纱！
本研究的denovo测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
派森诺生物可提供小基因组（细菌、真菌、细胞器、DNA/RNA病毒）测序服务，基于高通量测序技术，获得基因组的图谱信息，并在结构基因组学、比较基因组学层面通过差异分析、同源基因分析、共线性分析、物种进化分析等手段探究小基因组的性质，为溯源和进化研究等提供证据。
如果您想了解更多内容，欢迎在下方留言给我们，或发邮件到我们微生物基因组产品线邮箱：microsupport@personalbio.cn，我们期待您的咨询！
本文部分内容参考了公众号“生命科学前沿”，若有侵权，请联系删除。
文章索引：
Qingyun Liu, Xiaojuan Wang, Xiangru Wang, et al. A novel human acute encephalitis caused by pseudorabies virus variant strain. Clinical Infectious Diseases, ciaa987.
原文链接：
https://academic.oup.com/cid/article-abstract/doi/10.1093/cid/ciaa987/5872012?redirectedFrom=fulltext
