2020-09-25
期刊：《International Journal of Biological Macromolecules》
影响因子：5.162
最近，派森诺再次与西北工业大学合作，在《International Journal of Biological Macromolecules》上发表研究论文，通过模拟消化道功能和人粪便菌群体外发酵，对沙蒿多糖的潜在益生元特性进行了科学评估。
值得一提的是，本研究使用Illumina NovaSeq PE250模式对肠道菌群16S rRNA基因V3V4区进行测序，并且使用了QIIME2的新分析流程（包括DADA2生成ASV、PICRUSt2功能预测分析等）。NovaSeq具有超高测序通量（点击查看），研究成果当然也容易被期刊接受啦！
研究背景
首先，什么是益生元呢？
益生元，是一类不易被人体消化、需要依靠肠道菌群降解、对宿主产生有益功能的食物成分，主要包括各种膳食纤维等物质。益生元通常以低聚糖的形式存在，如低聚果糖、低聚半乳糖等就是比较常见的益生元种类啦。一般来说，它的作用主要有以下几点：
1、选择性地刺激和促进一种或多种有益菌的生长；
2、调节肠道菌群、促进肠道蠕动；
3、增强胃肠道屏障等。
那么，沙嵩多糖是什么呢？沙嵩多糖是从沙嵩种子中提取的一类水溶性多糖，即ASKP。单糖组成为鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖。另外，ASKP又可以进一步分为两个主要组分，比例约为1:1，一种是支链木聚糖（60P），单糖组成为鼠糖、阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和木糖；另一种是葡甘露聚糖（60S），单糖组成为阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖和甘露糖。前期研究表明，ASKP可以作为一种潜在的乳化剂，降低油/水界面张力；能减轻糖尿病db/db小鼠的高血糖和高脂血症；可以部分逆转肠道菌群的失调等。然而，关于ASKP的胃肠消化和发酵特性研究却很少报道。
研究方法
实验方案：
1、模拟胃肠消化
2、体外发酵
3、肠道微生物群组成及其代谢分析
实验对象：沙蒿种子
测序技术：Illumina NovaSeq PE250高通量测序
测序模式：微生物组细菌16S rRNA基因V3V4区测序
分析手段：基于QIIME2，通过DADA2及性能序列处理，并使用PICRUSt2进行功能预测
实验方案
PART 01、分子量变化、还原糖产生、碳水化合物消耗及pH变化
图1 人体粪便菌群模拟胃肠消化和体外发酵过程中的多糖HPSEC色谱图
A-C：模拟胃消化；D-F：模拟肠道消化；G-I：人体粪便微生物群体外发酵
图1表明，HPSEC色谱图分析显示各多糖组分的峰在模拟胃肠道消化过程中没有显著变化，ASKP及其两个组分可通过上消化道转运而不发生显著降解。图1G-1I表明，在体外发酵过程中，各多糖组分的分子量均有所下降，保留时间逐渐延长，但发酵后没有新的多糖峰产生。这些结果表明，所有多糖组分都能被人体粪便菌群降解。
图2 人体粪便菌群体外发酵过程中碳水化合物消耗（A）和pH（B）的变化
PART 02、体外发酵过程中SCFAs含量的测定
图3 体外发酵24h后SCFAs终浓度和乙酸-丙酸比值的差异
首先，作为肠道菌群发酵多糖的最终产物——SCFAs，它在维持宿主健康方面发挥着重要的作用，如调节代谢和免疫功能。丙酸可以调节免疫细胞，增加抗菌因子的产生。丁酸已被广泛认为是大肠细胞的能量底物，具有增强肠上皮屏障的功能。SCFAs的含量可能是影响其功能的重要因素，如调节宿主能量获取和代谢。
图3表明，各多糖组分均能显著促进总SCFAs和特异性脂肪酸的产生。与FOS相比，所有多糖都表现出更强的提高丙酸产量和降低乙酸：丙酸比值的能力；同时，60S提高丙酸产量和降低乙酸：丙酸比值的能力强。总体而言，发酵过程中SCFAs组成和含量的变化基本与碳水化合物消耗和pH值的变化一致（图2）。基于促进SCFAs产生能力的不同，ASKP和60S可能比60P具有更好的调节宿主代谢的能力。
PART 03、体外发酵后肠道菌群的组成及其功能预测分析
图4 不同分组之间肠道菌群的菌群Alpha多样性比较
到达远端消化道的难以消化的多糖可被肠道菌群选择性利用，引起生理变化（如pH和氧水平的改变），进而调节肠道菌群的组成，激活有益菌群的增殖。
在评价肠道菌群多样性时，首先采用Chao 1和Observed species指数反映物种的丰富度，Shannon和Simpson指数反映群落的多样性。如图4所示，多糖组中Chao 1指数和Observed species均显著低于BLK组，但显著高于FOS组，并且ASKP和60S组均显著高于60P组。三种多糖组的Shannon和Simpson指数相对于BLK组有所增加，60P组和60S组显著高于ASKP组。
图5 体外发酵后肠道微生物群的组成
为了进一步评价肠道菌群的多样性组成，通过PCoA分析和基于Bray-Curtis距离的聚类树来描述不同分组菌群结构之间的相似程度。图5A的PCoA分析表明，根据轴1所示信息，ASKP和60P组与其他三组明显分离；根据轴2所示的信息，60S组与BLK和FOS组分离。在图5B中，不同的类群也被清晰地分开了，它们在聚类树中的相似性与PCoA的结果一致。
根据门水平的细菌分类学分析，厚壁菌门、拟杆菌门和变形杆菌门是主要的分类单元。FOS和多糖组都抑制了厚壁菌门的相对丰度，其中ASKP和60P对厚壁菌门的抑制能力显著高于60S。另外，相对于BLK组，ASKP、60P和60S显著增加了拟杆菌门的相对丰度，而FOS显著抑制了拟杆菌门的相对丰度。
FOS组pH值较低可能是厚壁菌门/拟杆菌门比值增加所致。ASKP表现出更强的提高拟杆菌门相对丰度的能力。相对于BLK组，FOS中变形菌门的相对丰度显著升高，而ASKP和60S组则显著降低。在门水平上，拟杆菌门是肠道中含量最高的门之一，因为它能够广泛地利用复杂的碳水化合物。厚壁菌门/拟杆菌门比例的降低通常与宿主获取能量的增加有关。此外，变形菌门普遍增多被认为是肠道微生物失调的潜在迹象，并与糖尿病、炎症和癌症有关。ASKP抑制厚壁菌门的能力在很大程度上与60P有关，抑制变形菌门的能力一定程度上和60S有关。ASKP及其两个组分在门水平上调控肠道菌群结构，有助于预防代谢和免疫紊乱。
图6 在ASV水平上采用LEfSe分析比较肠道菌群的差异物种
A：LDA值(log 10)大于3的直方图；B：基于LEfSe分析的不同ASVs相对丰度热图；C：不同分类学水平下的相关分类学信息。
根据LEfSe分析的结果，可以看出ASKP可显著提高ASV 78（Bacteroides）的相对丰度，60S可显著提高ASV 1（Parabacteroides）和ASV 12（Collinsella）的相对丰度。拟杆菌属通常具有利用多糖的能力，它与丙酸在SCFAs中的比例呈正相关。Parabacteroides属也可以利用多糖，通过脂肪酸生物合成的代谢途径产生SCFAs。Collinsella属于放线菌，可利用多种碳水化合物，被认为是一种有益的属。特定细菌类群相对丰度的增加通常和参与消化降解多糖有关。因此，ASKP和60P主要被拟杆菌属利用，而60S则主要被Parabacteroides和Collinsella利用。
图7 碳水化合物代谢、脂质代谢和氨基酸代谢相关KEGG通路的热图
PICRUSt2菌群功能预测显示，多糖可显著改变菌群的代谢途径。与60S相比，ASKP和60P对细菌、碳水化合物和氨基酸代谢的抑制能力更强。ASKP及其各组分对胆汁酸代谢均有显著促进作用。
研究结论
1、沙蒿多糖组分显示出益生元潜力；
2、所有的组分通过胃肠道而不降解；
3、所有组分都表现出促进SCFAs产生和降低发酵液pH值的能力；
4、所有组分都能一定程度上调节肠道菌群的组成；
5、所有组分都极大地改变了菌群功能通路。
总体而言，本研究采用测序技术和分析方法，对于菌群组成和代谢的分析是研究亮点，增强了研究的说服力。
本研究的测序和部分数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。希望大家多多关注我们哟！
文章索引：Junjun Li,Bing Pang,a , Ximei Yan et al. Prebiotic properties of different polysaccharide fractions from Artemisia sphaerocephala Krasch seeds evaluated by simulated digestion and in vitro fermentation by human fecal microbiota
点击阅读原文：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0141813020336151
