2020-10-15
近日，派森诺生物与上海交通大学携手，在微生物基因组领域的《Journal of Hazardous Materials》发表研究成果！
影响因子 9.038
研究背景
多环芳香烃是由两个或者两个以上苯环组成的有机污染物，如萘和芴。杂环芳香烃是由其他元素组成环状结构的化合物，如二苯并呋喃（DBF）和二苯并噻吩（DBT）。多环芳香烃和杂环衍生物主要是由化石和固体生物燃料不燃烧、高温工业过程和炼油厂废水中产生。自2003年以来，已产生了约11.6万吨多环芳香烃，造成环境污染并威胁人类健康。芴是一种毒性很强的三环芳烃，其杂环衍生物（DBF和DBT）通过呼吸或直接接触皮肤对人类造成严重的健康威胁，如可导致畸形、癌症、基因突变和染色体畸变。
考虑到多环芳烃的物理和化学处理是能源、成本、化学密集型的，甚至会造成二次污染；生物修复是生态友好的和可持续发展的，在过去的20年中得到了相当大的关注。前人报道的几种能利用芴、DBF或DBT的微生物仅利用这些污染物中的一种作为唯一的碳源，或通过与其他化合物共代谢来降解DBF/DBT，很少有菌株能够同时降解这三种化合物。虽然已有文献报道了DBF和DBT降解的几个关键基因和酶，但目前对芴、DBF和DBT完整的分解代谢途径及相关降解基因的认识还很缺乏。
研究材料与方法
1）菌株分离与鉴定
菌株来源：从天津多环芳烃污染和石油化工污染的土壤和泥浆中分离得到Pseudomonas sp. MPDS菌株（可利用芴、DBF、DBT进行生长）；
鉴定：设计16SrRNA引物，并用MEGA 5.2.2 构建进化树。
2）多环芳烃及其杂环衍生物的培养和降解条件：对不同的底物、温度、转速和底物添加量进行了检测。
3）测序
①基因组Illumina MiSeq 和 PacBio
②转录组：Illumina
4）RT-qPCR分析：检测萘基因簇中6个基因和16S基因。
研究结果
菌株MPDS的分离与鉴定
分离得到一株降解多环芳烃和杂环衍生物（包括萘、芴、二苯并呋喃、二苯并噻吩）的菌株MPDS。MPDS菌株的16S rRNA基因与油菜假胞单菌的16S rRNA基因的同源性为99%，系统发育树显示的结果也接近。这种已鉴定的MPDS菌株对包括氯霉素、氨苄青霉素和卡那霉素在内的多种抗生素具有抗药性。
萘、DBF、DBT和芴的生长条件及降解能力
为了确定4种底物的生长条件和降解能力，对好氧菌株MPDS在不同转速、不同温度、不同萘、芴、DBF和DBT用量下进行了培养。结果发现MPDS菌株在高温下几乎不生长，生长温度为25℃，生长转速为200rpm，萘用量远高于DBF、DBT和芴（与菌株MPDS对萘的降解能力较强有关）。在条件下，对菌株MPDS的降解能力进行了检测，发现其能在84h内完全降解50mg萘，96h可降解65.7%的DBF(5 mg/50mL)和32.1%的DBT(5 mg/50mL)，72h可降解40.3%的芴(5 mg/50mL)。
菌株MPDS的基因组分析
MPDS菌株组装出1条环状染色体，基因组大小6,213,959bp，GC含量为60.25%，有5534个编码基因，5个rRNA操纵子和65个tRNA基因。在基因组的27933kbp区域预测得到编码多环芳烃和杂环芳烃降解的基因，包括负责萘降解的必要基因, 推测基因nahBFCED参与顺式萘二氢二醇向水杨酸的转化。在基因组注释的基础上，该菌株还发现了其他芳烃降解基因，包括4-羟基苯甲酸-3-单加氧酶、4-羟基苯乙酸异构酶和3-苯丙酸双加氧酶(HcaE)。这些酶的底物均为单苯环化合物，推测它们参与了多环芳烃降解过程中下游代谢产物的降解。同时还预测了一些功能基因，这些基因可能在利用硝酸盐、合成氨基酸、转移和吸收含C化合物方面是必不可少的。
萘、DBF、DBT和芴生物降解途径的研究
1）萘降解途径
用LC-MS鉴定了萘降解中间产物的降解途径，1，2-二羟基萘、水杨酸和邻苯二酚分别出现在4.200min、3.152min和3.834min，质谱m/z值分别159.0456、137.0247和109.0304 (图A)。因此，推测萘的降解途径是水杨酸途径(图B)。
2）DBF降解途径
从DBF的发酵样品中检测到新的中间峰，包括3-(3‘-氧基苯并呋喃-2’-基)丙酸、2-(3‘-氧基苯并呋喃-2’-基)乙酸等（如图F）。但DBF侧向双氧水降解途径中产生的黄色毒性中间代谢物HOBB尚未被鉴定。故制备了HOBB作为静息细胞反应的唯一底物，结果显示菌株MPDS在45小时内降解了0.2 mm HOBB，表明菌株MPDS可以通过侧向双氧降解途径降解DBF，解决了该途径通常被HOBB阻断的问题。同时用GC-MS在11.097min检测到硅基化水杨酸 (图G)。表明菌株MPDS具有DBF的侧向双加氧途径，第一步是将DBF水解为HOBB，然后降解为水杨酸(图H)。
3）DBT降解途径
采用LC-MS检测到DBT侧向降解途径中的典型产物：1，2-二羟基二苯并噻吩、3-羟基-2-甲酰基苯并噻吩、2，3-二羟基苯并噻吩和硫代水杨酸(图I)。这些中间体分别出现在18.513min、3.018min、3.800min和2.918min，质谱m/z数据分别为215.0176，177.0024，165.0065和153.0013 (图I)。同时，GC-MS(衍生化后)在12.692min检测到硅烷化的硫代水杨酸(图J)。这些结果表明，菌株MPDS通过侧向双加氧途径将DBT降解为硫代水杨酸(图k)。
4）芴降解途径
用LC-MS法从荧烯样品(图C)分别在7.179min、3.217min和3.217min鉴定出9-荧醇、2-丙酸-1-吲酮和2-乙酸-1-吲酮。此外，用GC-MS(衍生化后)在12.951min检测到了9-荧酮的相关代谢物(图D)。因为9-荧醇和9-荧酮是角双加氧途径的代谢物，2-丙酸-1-吲哚和2-乙酸-1-吲酮属于侧向双加氧途径，故推测菌株MPDS可能同时含有角状和侧向的双加氧途径(图E)，但降解芴的代谢途径仍有待进一步研究。
总之，在菌株MPDS中，DBF、DBT和芴的生物降解是通过侧向双氧合途径进行的，而这种途径通常存在于共代谢菌株中。在MPDS菌株基因组中未发现类似的DBF、DBT或芴降解基因。因此，推测菌株MPDS可能携带了DBF、DBT和芴降解的侧向双氧合途径的新的代谢基因簇。
转录组分析
以DBF为转录组数据分析的基质，来寻找潜在的降解基因簇；数据分析发现阴性对照组(1%甘油培养)和实验组(DBF培养)有870个基因在表达水平存在差异，通过聚类分析确定了具有相似表达水平的基因(图B)。KEGG途径富集分析发现，差异表达基因主要与缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解、乙醛酸和二羧酸的代谢以及丙酸的代谢途径有关(图C)。
结合之前分离并报道了另一株降解DBF的假单胞菌株FA-HZ1，对这两株菌株的基因组序列进行了联合分析发现这两株毒株在249个基因中具有较高的序列同源性(80%以上)。此外，还发现了13个序列高度相似的基因，这些基因在MPDS株的转录组数据中上调。
萘基因簇的实时定量PCR(RT-qPCR)
根据基因组数据和转录组数据发现菌株MPDS中存在一个萘降解基因簇，其中 nahAa、Nahab和nahAc的表达上调。为了确定该基因簇在萘降解中的作用，对位于萘降解基因簇上游和下游的参考基因以及相关基因进行了实时定量PCR。结果显示：NaHA和NAHB的表达分别是对照组(甘油)的37.8倍和42.2倍、nahh上调36.1倍。而编码水杨醛脱氢酶、2-羟色烯-2-羧酸异构酶和乙醛脱氢酶的3个基因(nahf、nhd和naho)则没有明显上调。由此说明菌株MPDS萘基因簇中的一些基因可能是由萘或其中间代谢产物诱导表达的，但也有一部分是结构性表达。
研究结论
1）假单胞菌菌株MPDS能够利用萘、芴及其杂环衍生物DBF和DBT作为生长的唯一碳源，并能通过侧双氧代谢途径对芴、DBF和DBT进行生物降解；
2）测定了菌株MPDS的降解能力，阐明了四种底物的降解途径，鉴定了萘降解的功能基因，并分析了潜在基因的基因组序列和转录组数据；
3）对菌株MPDS的基因组和转录组进行了分析，发现了一个萘降解基因簇，命名为nahAFBCED；
4）菌株MPDS和另一种DBF降解菌的比较基因组分析揭示了潜在的DBF降解基因；
综上所述，此研究结果进一步了解了萘、蒽、DBF和DBT生物降解的分子机理，并将有助于污染环境的生物修复。
本研究的denovo测序和转录组测序工作由
上海派森诺生物科技股份有限公司完成
文章索引：
Yunli Liu , et al. A Pseudomonas sp. strain uniquely degrades PAHs and heterocyclic derivatives via lateral dioxygenation pathways.Journal of Hazardous Materials (2020)
