2020-10-28
发表期刊：Journal of Hazardous Materials
影响因子：9.038
文章题目：Transcriptomic analysis of Raphidocelis subcapitata exposed to erythromycin: The role of DNA replication in hormesis and growth inhibition
技术手段：RNA-Seq
派森诺生物与西北大学携手合作，于近期在Journal of Hazardous Materials上发表了红霉素对羊角月牙藻毒理学机制的研究成果，影响因子9.038分。
研究背景
在药品上市申请过程中，往往通过受试藻类的半浓度效应（EC50）来评估该药品毒性阈值和环境危害表征。但此类毒性测试经常采用远高于环境中检测到的药物浓度，而生态毒理学方面的进展已经从研究高浓度污染物的急性毒性转移到研究环境相关暴露的慢性影响，导致人们更多地关注受试藻类基因表达模式的变化。基于NGS的RNA测序技术允许量化全基因组水平的基因表达，然而目前这种方法还没有应用于阐明藻类长期暴露于药物的分子机制。
红霉素（ERY）是一种常用的治疗呼吸道感染的大环内酯类抗生素，鉴于其对藻类的潜在环境危害和风险，ERY已被列入欧盟水框架指令的观察名单。由于羊角月牙藻已有完整的基因组测序结果，且可被ERY引起毒物兴奋效应，因此它们可作为阐明抗生素在水藻中的作用机制的代表。
研究方法
将羊角月牙藻分别暴露于4种不同浓度的ERY中，并命名为对照组（0μg/L）、低ERY组（4μg/L）、中ERY组（80μg/L）和高ERY组（120μg/L）。暴露实验进行7天，分别于2、4、7天对各组进行细胞数统计，于第7天收集各组的羊角月牙藻进行转录组测序，并基于测序结果，挑选关键差异基因进行RT-qPCR验证。
研究结果
1、暴露于ERY后，羊角月牙藻的生长状况
ERY对羊角月牙藻生长的影响如图1所示。与对照组相比，低ERY组的羊角月牙藻生长在7d的ERY处理中被检测到明显的毒物兴奋效应，表现在细胞密度提高21.9%。然而，在中、高浓度组，羊角月牙藻生长呈剂量依赖性下降，细胞密度被显著抑制了52.0%和65.4%。
图1. 7天实验中羊角月牙藻的生长曲线
2、差异表达基因
在羊角月牙藻中共检测到13384个转录本(图2A)。就各组基因表达模式而言，三次重复的相关系数约为0.99(图2B)，具有显著的高相关性。与此同时，PCA分析显示，对照组和低ERY组的基因表达簇与中、高处理组的基因表达簇有所区别(图2C)，这与heatmap检测结果一致(图2D)。与对照组相比，低ERY组鉴定出218个差异基因(198个上调，20个下调)，中ERY组鉴定出950个差异基因(332个上调，618个下调)，高ERY组鉴定到2896个(1299个上调，1597个下调)(图2E)，有趣的是，低ERY组的大多数差异基因上调表达，而中、高ERY组的大多数差异基因下调表达。
图2. 暴露于ERY7天后，羊角月牙藻的转录组分析
3、GO、KEGG富集分析和转录因子分析
GO分析是为了研究受ERY影响的基因在CC、MF和BP中的作用。简单地说，在低ERY组中，显著富集的GO条目与DNA复制过程相关；在中ERY组中，显著富集的GO条目与叶绿素代谢有关；高ERY组的差异基因主要富集于叶绿素代谢和DNA复制方面的GO条目。因此，可认为这些生物学过程在ERY对藻类生长的抑制中发挥了重要作用。
在KEGG功能途径和转录因子水平上，与GO富集结果一致，ERY处理也会影响与DNA复制和叶绿素代谢过程相关的途径(表1)。
表1. ERY处理影响的关键通路列表
讨论
通过分析转录组的差异基因及KEGG富集分析结果，可得出一种推测：ERY处理干扰了叶绿素a合成、碳同化、氧进化和氧化应激相关的信号通路。与这一假设相一致的是，光合生物体的碳固定以及卟啉和叶绿素代谢途径在中、高ERY中分别受到了上下调节。在高浓度下，ERY进一步抑制了参与I期、II期和III期异种生物代谢、类固醇、维生素和脂肪酸生物合成的几个基因的表达，并诱导了负责清除活性氧(ROS)的基因。特别地，DNA复制信号通路在低ERY和高ERY处理组中存在相反的差异表达情况。作者将差异基因按照参与不同生化反应进行分类，进行具体讨论。
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A 与异种生物代谢有关的基因
在藻类中，外源生物经历了I、II和III期代谢过程，这是一种解毒作用。在本研究中，参与I期、II期和III期代谢的基因的表达水平在中、高ERY处理组中均持续受到抑制。具体来说，参与解毒系统I期的Cyt P450、ABHs和AOs在中、高ERY组中均下调；参与解毒系统II期的GST仅在高ERY组下调表达；参与Ⅲ期-胞吐作用的ABC转运蛋白家族基因在不同浓度处理组中被抑制。
B 与脂质代谢和氧化应激相关的基因
脂肪酸和酮体是乙酰辅酶a代谢的两个主要过程。在高ERY组中，下调差异基因富集于脂肪酸生物合成途径，而上调差异基因富集于酮体合成途径。这表明，ERY阻碍了乙酰辅酶a向长链脂肪酸的转化。
氧化应激方面，高ERY组中mvp17和sod2基因上调表达，这二者是抗氧化系统中的生物标志物，上调表达可导致羊角月牙藻中ROS含量增加。此外，高ERY组中检测到过氧化物酶基因：pex2、pex10和pex19上调表达，说明ERY可通过诱导这类基因从而促进过氧化物酶体的生物发生。
C 与DNA复制和修复有关的基因
在高ERY处理组中，参与DNA复制过程的多个基因的表达被抑制，下调基因包括解旋酶的mcm2、mcm3、mcm6，参与复制叉形成和引物结合的pcna、rfc1、rfc2_4 rfc3_5，以及参与伸长的pola1、pri2、pold1、pold2。与此相反，在低ERY组的羊角月牙藻中，参与DNA复制的5个基因：mcm2、mcm6、pri2、pole2和rnaseh2a上调表达。这与表型实验的结果一致，说明DNA复制是化学试剂藻类毒性试验中经常检测到的毒物兴奋效应的分子机制。
此外，高ERY组的KEGG富集分析结果显示，由于有10个下调的差异基因富集，DNA复制错配修复通路被抑制，据此推测ERY的毒性机制可能与其有关。
D 与碳固定有关的基因
羊角月牙藻的生物固碳有C3和C4两个途径，在本实验中，中、高ERY组中的alt均下调表达，从而提高C3途径的CO2浓度，促进葡萄糖的生成。此外gapa、rpe、pgk的上调表达也有助于提高CO2的吸收效率。
E 与光合色素和生物素合成有关的基因
光和色素方面，中、高ERY组中的叶绿素a合成量可能降低，因为该通路中几个关键酶的表达明显降低：chIH、bchM、chIE、dvr、por。然而，不同浓度ERY处理下，参与叶绿素b和类胡萝卜素生物合成途径的基因没有明显改变，表明ERY对它们的合成没有不良影响。
生物素代谢方面，高ERY组的fabF、fabZ和fabI基因下调表达，它们可通过下调参与Pimeloyl-ACP合成的基因来抑制生物素的合成；与此同时，hlcs上调表达以弥补生物素的损失。由于生物素是参与脂肪酸合成中的酶的辅助因子，因此ERY可能通过抑制生物素代谢来抑制脂肪合成。
F 与甾体生物合成相关的基因
萜类主链生物合成和倍半萜和三萜生物合成是甾体生物合成的两条前体途径。在中ERY组中，参与萜类主链生物合成非甲羟酸途径的fdps和ispE下调，与此相一致，高浓度的ERY也抑制了4个基因的表达。
文章小结
本文研究了红霉素(ERY)对藻类生长和转录组的影响，发现DNA复制通路的诱导可能与藻类的毒物兴奋效应有关，与DNA复制相关的基因在80和120 μg/L的ERY中均有下调，另外碳固定、叶绿素a合成和脂肪酸途径受到干扰，具体见下图：
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
原文索引：
Guo J , Ma Z , Peng J , et al. Transcriptomic analysis of Raphidocelis subcapitata exposed to erythromycin: The role of DNA replication in hormesis and growth inhibition[J]. Journal of Hazardous Materials, 2020, 402:123512.
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https://doi.org/10.1016/j.jhazmat.2020.123512
