2020-11-03
发表期刊：《frontiers in Microbiology》
影响因子：4.235
近日，派森诺生物与河海大学携手，在微生物基因组领域的《frontiers in Microbiology》（影响因子4.235）发表研究成果！
研究背景
琼脂是许多红藻细胞壁的主要成分，是一种复杂的水溶性多糖，由琼脂糖和琼脂多糖组成。琼脂糖是由重复的D-半乳糖和3，6-脱水-L-半乳糖单元通过α-1，3-和β-1，4-糖苷键连接而成的线性大分子，而琼脂糖素是琼脂糖的衍生物，其重复单元是甲基化、丙酮化、磺化或糖基化的半乳糖部分。琼脂酶是一种重要的琼脂裂解酶，参与从琼脂糖中生产寡糖或单体糖。产生琼脂酶的细菌大多来自海洋环境，这些细菌在分类上属于不同的属，如假单胞菌、类单胞菌等。虽然琼脂利用在弧菌物种中不是特别普遍，但已经从不同的琼脂分解弧菌菌株中纯化并鉴定了琼脂酶。
弧菌是革兰氏阴性专性异养细菌，以自由生活群体或与多种水生生物共生的形式栖息在海洋和河口环境中，这是一个多样化的属，有超过120个已确认的种。一些弧菌对海洋动物和人有致病性，而大多数弧菌是非致病性的，是海洋微生物群落的正常组成部分。已知弧菌物种使用复杂的有机碳水化合物，如多糖(纤维素、甲壳素和琼脂等)作为碳和能源，并在环境碳循环中发挥重要作用。
研究材料与方法
菌株分离
柠檬酸硫代硫酸盐胆汁盐蔗糖(TCBS)平板分离了150株弧菌，其中3株进行了琼脂糖降解活性的表型试验，活跃的菌株HN897进行高通量测序和基因敲除实验进行验证。
测序平台
Illumina Miseq+Pacbio RSII
研究结果
01、菌株HN897的基因组特征
通过二代测序和三代测序组装得到两个完整的环状染色体，其基因组特征为Vas1（染色体1）大小3,120,326bp，GC含量46.06%，预测到2801个CDS、110个tRNA和34个rRNA，NR注释到2736个基因；Vas2（染色体2）大小1,679,007bp，GC含量44.82%，预测到1487个CDS、6个tRNA和16个ncRNA，NR注释预测到1420个基因；其中两条染色体的NR注释结果中的基因有一般比对上Vibrio sp.C7基因组上。
02、菌株HN897的分类归属
根据GTDB，所有205个弧菌科代表中组成了一个单系科级群（图A）；根据NCBI分类，弧菌科的分类单元是弧菌目，但经过分类等级归一化后，GTDB分类将其重新归类为肠杆菌。但在进化树中HN897与140个弧菌成员分支在弧菌科亚树中，准确的来说，与星状弧菌菌株C7是统一个亚类（图B），ANI分析发现两个的相似性高达96.6%，进一步说明两株菌的亲缘关系较近。对这两株菌进一步进行比较发现，相似性高的区域包含了染色体的大部分编码区域（Vas1的CDS占95.5%，Vas2的CDS占77.2%）(图C、D)。
03、HN897的功能注释
Kegg注释总共得到2344个基因，有634个基因与代谢途径有关，特别是合成代谢类的；还有很多基因与不同的细胞信号通路有关，包括ABC转运蛋白通路、双组分系统和群体感应系统，且有一组参与碳和丙酮酸代谢以及糖酵解/糖异生作用的基因成分似乎相对完整。Pfam预测发现基因组的CDS至少有一个Pfam模型，丰富的结构域是钙粘蛋白_5，有116个命中，其中111个排列在长的CDS上；ABC转运结构域、信号转导相关的结构域也比较丰富。此外HN89经过碳水化合物预测发现得到一些相关基因并确定了碳水化合物结合模块（CBM）。
04、菌株HN897的β-琼脂酶基因谱
研究发现，β-琼脂酶8个GH亚家族成员与相似，其中HN897的GH16和GH50家族也包含在内。为了验证这一关系，基于72个GH蛋白序列的保守酶结构域构建进化树，结果显示所有的GH在GH亚家族水平上是一致的，进而将得到的8个β-琼脂酶归入GH50和GH16亚类（图A）。已鉴定的N末端疏水信号肽表明，GH50和GH16的成员都可能是分泌型的（图B）。
HN897的8个β-琼脂酶基因区域的基因簇与45个基因组的同源性分析表明，GH16s和GH50s代表两组可能起源相似的同源排列基因。不同的是VAS1_1339，它位于与其他GH16不同的染色体上。除了缺少一个GH50基因、几个生长素亚家族基因普遍存在移码以及部分基因存在倒位、异位和重排外，HN897和C7之间共线性总体是一致的(图C)。
05、Vas1_1339-琼脂分解表型的功能验证
对HN897的8个可能β-琼脂酶基因分别构建了敲除菌株组，琼脂斑点试验表明，其中7个菌株组的缺失突变体和野生型菌株相似（图A），Vas1_1339缺失株（△1339）的琼脂糖裂解酶活性丧失，但该基因在反式表达中恢复了琼脂糖裂解表型。酶活性测定发现△1339菌株培养上清液中琼脂酶活性明显低于野生型菌株和补充型菌株（图B）
使用PaperBLAST比对发现，Vas1_1339与弧菌V134菌株的一个半乳糖-琼脂酶基因agaV相似，只有两个氨基酸残基的差异。构建16S rRNA进化树发现V. astriarenae菌株（C7, C20,和推测的HN897）与V134相近，表明HN897菌株很可能为V. astriarenae。
研究结论
1.通过高通量测序获得HN897的完整基因组序列，预测发现该菌株可能存在丰富的糖苷水解酶；
2.通过序列聚类和蛋白质结构域结构的比较，鉴定了8个可能的β-琼脂酶编码基分别属于GH50和GH16家族；
3.基因敲除和互补实验证明，GH16-16型β-琼脂酶编码基因Vas1_1339对于HN897菌株的琼脂糖表型是不可少的；
综上所述，这些结果不仅为理解细菌琼脂糖解的生化机制提供了依据，也为更详细地了解V.astriarenae HN897基因组的进化和生理功能提供了依据
本研究的denovo测序工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
文章索引：Liu, Yupeng Jin, Xing-Kun Wu, Chao Zhu, Xinyuan Liu, Min Call, Douglas Zhao, Zhe. (2020). Genome-Wide Identification and Functional Characterization of β-Agarases in Vibrio astriarenae Strain HN897. Frontiers in Microbiology.
