2020-11-13
期刊：《Journal of Hazardous Materials》
影响因子：9.038
近日，派森诺生物与齐鲁工业大学生物工程学院、生物基材料与绿色造纸国家实验室合作，研究了产γ-PGA的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis W7）和淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens W25）对土壤Cd固定化、γ-PGA产生、镉污染土壤中莴苣镉吸收、根际土壤细菌群落以及对莴苣生长和品质的影响及机制。研究成果发表在环境领域学术期刊《Journal of Hazardous Materials》（IF=9.038）。
一、研究背景
土壤镉（Cd）污染日益严峻，对人体健康危害极大。降低土壤镉生物有效性、减少植物对镉的吸收已成为国内外研究热点之一。土壤重金属固定剂通过吸附、络合和沉淀作用，降低重金属的生物有效性，减少重金属从土壤向植物转移。然而，持续添加这些有机、无机固定剂可能会对土壤性质、结构和生态系统产生有害影响。近年来，植物生长促进菌（PGPB）作为一种新型土壤固定剂，通过产生铁载体、吲哚乙酸（IAA）和降低土壤中重金属的有效性，在促进植物生长和减少金属吸收方面得到了广泛的应用。
聚γ-谷氨酸（γ-PGA）是一种由D/L-谷氨酸形成的生物大分子，由芽孢杆菌胞外产生，其无毒、富含羧基、含有大量能与金属离子结合的阴离子官能团，是一种生物吸附材料，也被广泛用作生物肥料，具有广阔的应用前景。然而，目前关于γ-PGA产生菌对污染土壤重金属钝化和植物生长影响的研究还未见报道。
本项工作研究了产γ-PGA的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis W7）和淀粉液化芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens W25）对土壤Cd固定化、γ-PGA产生、镉污染土壤中莴苣镉吸收、根际土壤细菌群落以及对莴苣生长和品质的影响及机制。
二、研究方法
首先将Cd污染土壤中分离得到的菌株W7和W25接种到不同浓度Cd2+（0、3和6 mg/L）的土壤滤液中，分别在0、24、48、72与96小时进行滤液中水溶性Cd与γ-PGA的测定；然后通过盆栽实验，在受镉污染土壤中的莴苣根部周围开沟，分别添加两种菌株悬浮液接种，以非接种菌株作为对照组，对根际土的化学性质与植物生化指标进行分析；最后通过对根际土壤进行16S rRNA基因高通量测序，评估两种菌株对根际土壤细菌群落的影响大小。
三、研究结果
3.1、土壤滤液中镉的固定化、pH值、细胞生长和菌株W7和W25的γ-PGA产生
下图A显示为土壤滤液中不同Cd2+浓度下菌株W7和W25的γ-PGA产生情况，可以看出当存在Cd2+时，γ-PGA浓度通常随时间增加。图B与图C中显示接种W7和W25菌株的土壤滤液与对照组相比，水溶性Cd的浓度分别有显著降低。其中水溶性Cd的浓度随着孵育时间的增加而降低，在6 mg/L Cd2+下孵育24-96 h时，菌株W25的水溶性Cd浓度明显低于菌株W7。
3.2、W7和W25菌株对莴苣生物量，品质和Cd含量的影响
下表中显示接种W7和W25菌株后，莴苣的可食组织干重、VC含量和可溶性蛋白质含量均有显著增加。但是，与未污染和Cd污染的土壤相比，硝酸盐含量有明显降低。值得注意的是，在高Cd污染土壤中，这些菌株可以显著降低莴苣叶片和根中的Cd含量，其中W25菌株比W7菌株具有更高的Cd吸收能力。同样的，在低Cd污染土壤中，W25菌株处理后的植物组织亦表现出较好的Cd吸收能力。
3.3、W7和W25菌株对根际土壤有效镉和γ-PGA产生菌相对丰度的影响
下图A中显示与对照组相比，在高Cd污染的根际土壤中接种两种菌株可显著降低DTPA-Cd含量。图B中显示在高Cd污染土壤中，接种W25菌株的DTPA-Cd含量明显低于接种W7菌株的Cd含量。图C中显示两种菌株的存在确实相对增加了受镉污染的根际土壤中产生γ-PGA的细菌的相对丰度。
3.4、W7和W25菌株对土壤酶活性的影响
土壤酶活性是监测重金属污染下，土壤生态系统动态和健康的重要指标。下图分别展现了这些菌株对根际土壤中的脲酶，转化酶，脱氢酶和碱性磷酸酶活性的影响情况。其中，在没有这些菌株的情况下，Cd污染土壤和非污染土壤之间的酶活性没有显著差异。但是，在接种菌株W7和W25后，未污染和Cd污染处理的脲酶活性均显著提高；且转化酶和脱氢酶在W25菌处理结果中较W7菌增加明显；碱性磷酸酶在两种处理条件下，亦有明显升高。
3.5、细菌群落的多样性和组成结构
本研究还通过16S rRNA基因的高通量测序，评估了根际土壤细菌的相对丰度和组成多样性。采用加权Unifrac距离的NMDS分析结果显示不同处理间菌群结构的变化情况。结果显示，接种菌株25的样品与其他两个处理组有明显分离，其菌群结构有明显变化。
通过随机森林方法对不同处理组中的重要菌属进行了研究，其中下图A中展现了重要度前20的菌属，包括Bacillus、Phycicoccus、Nitrospira与Aneurinibacillus等；图B则是对这重要度前20的菌属进行丰度热图的绘制，可以看出相同菌属在不同处理中丰度变化是不一致的。其中，在对照组中，Nonomuraea、Micromonospora和Craurococcus为主要丰度优势菌；在接种W7菌株处理组中，Actinomadura和Aneurinibacillus具有较高的相对丰度，而在接种W25菌株的土壤样品中的Sphingobium、Nitrospira与Phycicoccus占主导地位。
四、总 结
研究结果表明，两种菌株均降低了土壤滤液中Cd的浓度（16～75%），菌株W25产生γ-PGA和固定Cd的能力高于W7菌株。与对照相比，两种菌株的施用显著增加了莴苣的生物量（41-85%），减少了镉的吸收（19-41%），降低了有效镉含量（25-37%）。进一步研究发现，这些菌株通过提高土壤滤液中γ-PGA的产生量、pH值、鞘氨醇单胞菌Sphingomonas 和芽孢杆菌Bacillus 等的相对丰度（24-30%），从而固定化镉；通过提高镉污染土壤pH值和脲酶活性，降低土壤镉的有效性。所有这些因素都有助于降低Cd污染土壤莴苣中的Cd含量。此外，这些菌剂还通过提高土壤酶活性和产生IAA来改善土壤质量，促进了莴苣的生长，提高了VC和可溶性蛋白质含量。盆栽试验表明，接种这些菌株的莴苣食用组织中Cd含量低于FAO/WHO规定的叶菜类蔬菜的最高允许量。
综上所述，本研究利用产聚谷氨酸细菌钝化土壤Cd，为Cd污染农田的修复和农作物的安全生产，提供了一种环保、经济的技术途径。
参考文献：
Wang X , Dong G , Liu X , et al. Poly-γ-glutamic acid-producing bacteria reduced Cd uptake and effected the rhizosphere microbial communities of lettuce[J]. Journal of Hazardous Materials, 398.
原文链接
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0304389420311353
