2020-12-16
发表期刊：International Journal of Molecular Sciences
影响因子：4.556
文章题目：Integrated Analysis of Seed microRNA and mRNA Transcriptome Reveals Important Functional Genes and microRNA Targets in the Process of Walnut (Juglans regia) Seed Oil Accumulation
技术手段：RNA-Seq、small RNA-Seq
派森诺生物与西北农林科技大学携手合作，于2020年11月在《International Journal of Molecular Sciences》上发表了miRNA-mRNA之间的核桃油生物合成调控网络的研究成果。
研究背景
核桃是一种很有前途的木本油料作物，其核中含有丰富的多不饱和脂肪酸。油脂主要以脂肪酸甘油酯的形式存在，一般是植物种子中的三酰基甘油酯（TAG），作为能量和生物合成前体储存在油体内。现有研究充分证实脂质积累过程在转录水平上具有复杂的调控关系。但核桃油积累和脂肪酸代谢的调控机制尚不清楚，制约了含油核桃的选育和遗传改良。
Micro RNA（miRNA）是内源性的、单链的小的非编码RNA。已有研究表明，miRNA在植物生长、发育和抗逆性等一系列生化反应中发挥着重要作用。然而，到目前为止，对miRNA在核桃脂质生物合成过程中的作用知之甚少。
基于此，为了系统了解与核桃油生物合成相关的miRNA和mRNA之间的调控网络，对核桃油积累期间的miRNA和mRNA序列进行分析，旨在发现一些与核桃油积累相关的miRNA-mRNA调控模块。
研究方法
样本：开花后80天（G1）、100天（G2）、120天（G3）的“香玲”核桃果仁
实验方法：}mRNA测序、small RNA测序
测序平台：illumina Hiseq
研究结果
1、油脂含量和脂肪酸的动态分析
对核桃果实发育三个阶段的籽粒含油量呈上升趋势，从11.51%迅速上升到40.40%，再上升到53.20%。另外对籽粒脂肪酸组成进行了测定（表1），其中含量高的前5个成分为棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)、亚油酸(C18:2, n-6)和亚麻酸(C18:3, n-3)。5种脂肪酸的总相对含量在G1、G2和G3组均在97%以上。值得注意的是，C18:0和C18:1在三个采样阶段总体呈上升趋势，其余脂肪酸呈动态平衡或下降趋势。
表1 80、100、120日核桃仁油中脂肪酸含量的变化
2、核桃油积累期的关键基因
通过转录组测序比较了不同核桃样本在三个阶段的基因表达谱。通过对差异表达基因表达模式的聚类分析，发现其表现出明显的时间特异性表达模式（图1 A）。此外，发现G1 vs G2组有1890个差异基因，G2 vs G3组有3253个差异基因，G3 vs G1组有4020个差异基因（图1 B）。
图1 核桃仁不同发育阶段基因表达差异分析
为更好地研究这些差异基因在核桃油合成中的作用，对其进行GO和KEGG富集分析（图2）。G1 vs G2和G2 vs G3的差异基因中，KEGG通路富集显著的是“植物激素信号转导”(ko04075)，其次是“内质网蛋白加工”(ko04141)和“苯丙氨酸代谢”(ko00360)。“淀粉和蔗糖代谢”(ko00500)和“糖酵解/糖异生”(ko00010)在G2 vs G3的差异基因中也显著富集。在G3 vs G1的差异基因中，KEGG通路富集显著的是“糖酵解/糖异生”(ko00010)，其次是“植物激素信号转导”(ko04075)、“半乳糖代谢”(ko00052)、“半胱氨酸和甲硫氨酸代谢”(ko00270)和“色氨酸代谢”(ko00380)。最终，从13个脂质代谢通路中选择了8个与核桃油合成相关的主要通路，包括“亚油酸的新陈代谢”(ko00591),“脂肪酸生物合成”(ko00061),“脂肪酸降解”(ko00071),不饱和脂肪酸的生物合成(ko01040),“花生四烯酸代谢”(ko00590),“α亚麻酸代谢”(ko00592),“脂肪酸伸长”(ko00062),“甘油酯代谢”(ko00561)。
图2 差异基因的功能富集分析
3、差异miRNA和其功能分析
在9个文库中共鉴定出204个已知miRNA，并预测出554个新的候选miRNA。差异分析结果表明，G1 vs G2组检测到60个差异miRNA，G2 vs G3组检测到146个差异miRNA，G3 vs G1组检测到122个差异miRNA（图3）。
对差异miRNA进行靶基因预测以更好地了解它们的功能。共预测1784个靶基因，GO富集分析将靶基因的功能归纳为三大类，即生物过程(BP)、分子功能(MF)和细胞组成(CC)，这三大类又细分为1565个条目。在BP类中，富集程度高的是“苯丙素代谢过程”(GO: 0009698)、“木质素代谢过程”(GO: 0009808)和“苯丙素分解代谢过程”(GO: 0046271)。在MF类中，富集显著的条目主要与“对苯二酚:氧氧化还原酶活性”(GO:0052716)、“DNA结合”(GO:0003677)和“氧化还原酶活性”(GO:0016682)有关。在CC类别中，富集程度高的分别为“细胞核”(GO:00056340)、“膜界细胞器”(GO:0043227)和“细胞内膜界细胞器”(GO:0043231)。KEGG富集分析中，“代谢”类的通路最多，其中通路多的是“碳水化合物代谢”类,其次是“脂质代谢”类。
图3 差异miRNA在籽粒不同发育阶段的表达谱
4、miRNA参与核桃油合成途径
构建了16个与核桃油积累和脂肪酸合成相关的miRNA-mRNA调控模块，8个已知的miRNAs和9个新的miRNAs调节28个基因参与脂肪酸代谢和脂质合成。其中，jre-miRn105、jre-miRn434、jre-miR477d、jre-miR156a.2是调控核桃脂肪酸合成的关键miRNA。Jre-miRn411和jre-miR399a.1与油脂合成密切相关（图4）。
图4 核桃果实发育过程中油脂积累有关的miRNA-mRNA调控模块
文章小结
综上所述，miRNA作为转录后调控的重要因素，目前在核桃中报道较少，miRNA在核桃油生物合成中的作用也未见报道。本研究揭示了核桃油生物合成中可能存在的miRNA调控网络。本研究还筛选出了核桃油积累期间的一些关键基因，并对其表达模式进行了分析（图5）。希望在此基础上进一步完善核桃油的生物合成机理。本研究结果为核桃油的生物合成和改良提供了有价值的信息，也为油籽核桃的分子育种提供了新的思路。
图5 脂肪酸和TAG合成途径中的miRNAs和基因调控模式概述
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技股份有限公司完成。
