2021-06-15
期刊：Genomics
影响因子：6.2
文章题目：De novo assembly transcriptome analysis reveals the preliminary molecular mechanism of pigmentation in juveniles of the hard clam Mercenaria mercenaria
发表期刊：Genomics
技术手段：RNA-Seq+qPCR
派森诺生物与中国科学院海洋研究所携手合作，于近期在《Genomics》上发表了无参转录组分析揭示幼体硬壳蛤（Mercenaria mercenaria）色素沉着的初步分子机制相关研究成果。
/ 研究背景/
颜色是个体重要的表型特征，并且与伪装、免疫、体温调节等生物学功能相关。软体动物具有丰富的外壳颜色，但是，人们对贝壳色素沉着的了解仍然很有限。已有学者利用杂交进行的遗传分析表明，贝壳的颜色可以由基因调控。研究表明，钙信号转导、黑色素合成、卟啉和叶绿素代谢等相关基因参与生物外壳的色素沉着与调控。这些研究大多数以双壳类动物的外被膜作为研究材料，但是，双壳类动物幼体时期是开始色素沉着的重要时期却往往被忽视。
硬壳蛤（Mercenaria mercenaria）是一种有着重要商业价值的双壳类动物，其养殖品种具有丰富的壳色变异。本研究根据色素沉着情况将幼体硬壳蛤分为三组，采用RNA-Seq技术进行分析，从中鉴定出参与色素沉着的候选基因和相关代谢通路。
/ 研究方法 /
样本：无色素沉着幼体硬壳蛤（NP）、白色幼体硬壳蛤（W）、红色幼体硬壳蛤（OP）
实验方法：转录组测序
测序平台：Illumina NovaSeq
技术路线图见下：
/ 研究结果 /
1.转录组测序结果，注释以及差异表达基因（DEGs）分析
借助二代转录组测序技术，对NP、W、OP三组幼体硬壳蛤，每组三个重复，一共9个样品进行转录组测序。通过转录本拼接共得到149234个unigenes，N50为1567 bp，对unigene功能注释鉴定出很多与信号转导相关的基因。
为了评估在不同分组的基因表达量变化，对三组幼体硬壳蛤的转录表达情况进行两两比较。在OP vs NP比较组中检测到2133个上调基因，1708个下调基因。W vs NP比较组中有1824个上调基因和1628个下调基因。OP vs W比较组中发现179个上调基因和71个下调基因。
为了更好地了解DEGs的功能，作者进行了KEGG富集分析。结果显示，OP vs NP比较组富集了282条途径，其中有51条途径显示显著富集（表1），富集最显著的前20个代谢通路如图1A所示。W vs NP和OP vs W比较组分别富集了266和122条途径，且分别有45和15条途径显示显著富集（表2，表3），富集最显著的前20个代谢通路如图1B和图1C所示。DEGs主要在黑色素瘤、卟啉和叶绿素代谢以及ABC转运通路中富集。
表1 OP vs NP显著富集途径条目
图1A OP vs NP KEGG 富集分析
表2 W vs NP显著富集途径条目
图1B W vs NP KEGG 富集分析
表3 OP vs W显著富集途径条目
图1C OP vs W KEGG 富集分析
2.与色素沉着相关的候选基因鉴定
作者研究发现，红色硬壳蛤的黑色素和胡萝卜素浓度明显高于白色硬壳蛤。色素前体分子可以通过ABC转运蛋白运输到色素细胞，并且四吡咯是软体动物中另一种主要的色素。因此，作者挑选了黑色素瘤/黑色素生成、类胡萝卜素相关代谢通路、ABC转运体以及卟啉和叶绿素代谢的DEGs进行聚类热图分析。聚类结果如下：
A.在黑色素瘤/黑色素生成代谢通路途径中，W组首先与OP组聚集，然后与NP组聚集。在该通路中发现了小眼畸形相关转录因子（MITF）、酪氨酸酶（TYR）和钙离子结合相关基因。TYR是合成黑色素所必需的，MITF对TYR具有调控作用。TYR在OP和W组中高表达，MITF在W组中表达相对下调（图2a）。
B.在ABC转运体代谢通路中，W组先与OP组聚类，然后与NP组聚类。ABC转运体可能通过转运色素前体来介导色素沉着。相比于W和NP组，ABCA、ABCC和ABCG在OP组中高表达（图2b）。
C.类胡萝卜的摄取、运输和分解在类胡萝卜色素沉着中起着至关重要的作用。在类胡萝卜素相关代谢通路中清道夫受体、低密度脂蛋白受体相关蛋白和载脂蛋白等的Unigenes差异表达（图2c）。
D.与W组相比，OP组中卟啉和叶绿素代谢显著富集，表明该途径在硬壳蛤中红色素的形成中发挥了作用（图2d）。
图2 显示关注的KEGG通路中基因表达水平的聚类热图: A) 黑色素瘤/黑色素生成; B) ABC转运体; C) 类胡萝卜素相关代谢通路; D)卟啉和叶绿素代谢。
3.关键基因qRT-PCR验证
为了验证RNA-Seq数据的可靠性，作者从DEGs中选取10个 unigenes，使用qRT-PCR进行验证。如图3所示，转录组数据与qRT-PCR结果一致，在OP组中ABCA1, ABCA3, ABCC1和 ABCG5-like的表达量最高。
图3 10个基因的qRT-PCR验证
/ 总结 /
色素是贝壳颜色产生的主要原因。在本研究中，作者对非色素沉着、白色和红色的硬壳蛤进行了RNA-Seq分析，以探讨幼体硬壳蛤色素沉着的机制。DEGs有黑色素瘤/黑色素形成、ABC转运体、类胡萝卜素代谢相关途径、卟啉和叶绿素代谢，可能参与色素的形成和调控。这些发现表明黑色素和类胡萝卜素可能是硬蛤壳的主要色素。值得注意的是，与脂质转运、ABC转运蛋白、卟啉和叶绿素代谢相关的基因，可能是这些硬壳蛤壳呈红色的原因。
本研究的测序和数据分析工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。
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