2021-09-14
期刊：Chemosphere
影响因子：7.09
文章题目：Integrative analyses of transcriptomics and metabolomics in Raphidocelis subcapitata treated with clarithromycin
技术手段：RNA-Seq、LC-MS代谢组学
派森诺生物与西北大学携手合作，于近期在《Chemosphere》上发表关于羊角月牙藻经过克拉霉素处理后的转录组学和代谢组学联合分析的相关研究成果。
研究背景
人类滥用抗生素导致其能够在全球天然水域广泛检测到，鉴于抗生素对水生生物的潜在生态风险，其已被视为新兴污染物。克拉霉素（CLA）作为世界范围内常用的大环内酯类抗生素之一，可以抑制多种广谱生物、病原体和细菌的活性。已有研究表明，CLA对藻类具有很强的毒性，其排放到水生环境中可能对水生生物产生不利影响。抗生素旨在靶向生物体（如细菌）中的受体或生化途径。然而，类似的受体或途径也可能存在于非目标生物中，例如藻类。作为水生食物链的主要生产者，藻类在提供多种生态功能方面发挥着重要作用，包括固碳、物质输出和有毒物质积累。
羊角月牙藻（Raphidocelis subcapitata）在全球广泛分布、有可用的基因组和较短的生长周期，并且是世界范围内用于毒理学测试和风险评估的藻类模式物种。因此，本研究将羊角月牙藻作为试验生物。已报道从转录组和代谢组水平揭示了环境胁迫对藻类的影响，但目前还没有通过转录组学和代谢组学分析来阐明CLA在藻类中的作用机制。本研究旨在研究不同浓度CLA对羊角月牙藻的转录组学和代谢组学的影响，结果可以为藻类如何应对水生环境中的抗生素污染提供新的见解。
研究方法
羊角月牙藻分别在7种不同浓度的CLA中培养，浓度分别为0、3、10、15、20、25和40μg/L。生长抑制试验持续7天，分别于0、2、4、7天对细胞数量进行统计。7天后，收集对照组（0μg/L）、低CLA组（3μg/L）、中CLA组（10μg/L）、高CLA组（15μg/L）进行转录组测序，并根据转录组测序结果，挑选关键差异基因进行qRT-PCR验证；挑选对照组、低CLA组、中CLA组进行代谢组学分析。
研究结果
1.CLA对羊角月牙藻生长的影响
不同浓度的CLA处理7天后，羊角月牙藻的生长情况如图1所示。与对照组相比，除了低CLA组（3μg/L）外，其他CLA处理组的生物量均受到显著抑制。
图1 不同浓度CLA处理7天后的羊角月牙藻生长曲线
2.差异表达基因
在羊角月牙藻所有处理组中共检测到13383个转录本。基因表达模式表明，每个处理组的3次重复具有较高的相关性，相关系数大于0.97（图2A）。PCA分析显示，对照组的基因表达簇与低处理组接近，而中处理组和高处理组明显不同（图2B），在聚类热图中也发现了类似的结果（图2C）。与对照组相比，低、中、高CLA组分别检测到上调差异基因29、480、549个，下调差异基因19、155、410个（图2D）。
图2 不同浓度的CLA处理后，羊角月牙藻的转录组分析
3.GO、KEGG富集分析
在GO分析中，低、中、高CLA处理组分别富集了59、144和123个GO条目。为了确定CLA影响的代谢途径，对所有差异表达基因进行KEGG分析。结果显示，共有17个代谢途径显著富集，包括氨基酸代谢和糖代谢等途径（表1）。
表1 CLA处理后，各处理组与对照组相比显著富集的代谢通路
4.代谢组学分析
在正离子和负离子模式下分别检测出426和408个代谢物。与对照组相比，在正离子模式下，低、中处理组分别鉴定出77和36个差异代谢物；在负离子模式下，低、中处理组分别鉴定出134和84个差异代谢物。
5.差异代谢物的KEGG富集分析
在代谢水平上，对所有差异代谢物进行KEGG富集分析，以确定受影响的途径。图3显示了各组中前10个显著相关的途径。其中，代谢途径、次生代谢产物的生物合成、柠檬酸循环(TCA循环)和双组分调节系统在低、中处理组均富集。此外，乙醛酸和二羧酸代谢、氧化磷酸化和光合作用仅在低处理组富集。
图3 差异代谢物的KEGG通路富集分析
6.转录组学和代谢组学联合分析
联合分析结果显示，有7种化合物的转录本和代谢物之间存在一致性，包括：胞嘧啶核苷二磷酸（CDP）、腺嘌呤核苷二磷酸（ADP）、正磷酸盐/磷酸盐、丙酮酸、L-谷氨酸、甘油磷酸、甲基硫腺苷。这些化合物大多与ABC转运体、氧化磷酸化、光合作用、光合生物固碳和萜类主链生物合成等多种途径有关。
讨 论
已知CLA在浓度为20μg/L和40μg/L时可显著抑制羊角月牙藻的生长，而在浓度为5μg/L时未发现有害的影响，这与本研究一致。据报道，CLA在自然条件下，在不同的环境介质中具有高度的持久性，因此，在试验过程中，CLA光降解和生物降解不太可能发生。作者将差异基因和差异代谢物在生物过程中包括异生物质代谢、光合作用、氧化磷酸化和光合色素合成进行了讨论。
1.与异生物质代谢有关基因
在藻类细胞中，外源性化合物经过三个解毒阶段(即转化、偶联和分隔)。本研究中参与这三个阶段的变化基因有细胞色素P450 (Cyt P450)、细胞色素b5、醛脱氢酶(Aldh)、甲基转移酶(MT)和ABC转运蛋白家族基因。本研究中细胞色素b5和MT的上调有助于低处理组的羊角月牙藻代谢CLA；虽然在中度处理组中aldh、MT和ABC转运体家族基因上调，但可能不足以代谢全部CLA；CLA高处理组中cyt P450和MT的表达下调，可能抑制了羊角月牙藻的解毒能力。
2.与光合作用相关的联合分析
在本研究中，lhca4、lhca5、lhcb1、lhcb2、lhcb4等DEGs均与叶绿素光捕获蛋白复合物相关。其中，lhcb1、lhcb2、lhcb4在中、高处理组均上调，说明激发态的捕光天线蛋白增强了细胞捕获光的能力。然而，捕光天线的过度激发和强光也可能导致反应性化合物的形成，这可能会破坏整个光合单元（图4）。
3. 与氧化磷酸化相关的联合分析
在真核细胞中，氧化磷酸化是通过氧化某些代谢物和形成三磷酸腺苷(ATP)来释放能量的一种有效途径。代谢水平上，低处理组琥珀酸、延胡索酸、ADP和氧化磷酸化中磷酸的含量均升高，而在中处理组降低，相应的基因ppa、sdha和sdhb的表达趋势相似（图5）。Sdha和sdhb都与琥珀酸脱氢酶(SDH)的合成有关，SDH能够通过在FAD结合位点上还原O2的单价电子产生ROS。由此可见，低处理组某些代谢物氧化释放能量的能力增强，而中处理组被抑制，抑制SDH可能是诱导ROS产生的原因。
4.光合色素合成的联合分析
类胡萝卜素在植物的发育、光合作用和植物激素的产生中发挥着至关重要的作用。在本研究中，β-胡萝卜素羟化酶(crtz)在低处理组显著上调，中处理组类胡萝卜素合成的降低可能降低了藻细胞对ROS的抗性。高CLA处理组中参与将5-氨基乙酰丙酸前体转化为叶绿素a、b的一系列基因，包括heml、hemb、hemc、heme、hemf、hemy、por和dvr的表达水平降低(表1)，由于叶绿素a和b的降低，藻类的抗氧化能力可能会减弱，导致藻类细胞能量不足，降低其对ROS损伤的抵抗力。
图4 光合作用相关的联合分析
图5 氧化磷酸化相关的联合分析
文章小结
10μg/L和15μg/L浓度的CLA，经过7天处理后可显著影响羊角月牙藻的生长，而浓度为3μg/L的处理则无显著影响。转录组学和代谢组学联合分析表明，三种CLA处理组的羊角月牙藻的反应机制不同。在3μg/L中，类胡萝卜素生物合成基因的表达上调使羊角月牙藻对CLA具有足够的抗性。相反，10 μg/L和15 μg/L对羊角月牙藻的外生代谢、电子传递和能量合成均有负面影响。为了补偿损失的部分能量，藻类可以通过增加光合作用，通过反馈和调节机制获得更多的能量。然而，捕光天线的过度激发和强光也可能导致ROS的形成，对细胞造成损伤。同时，类胡萝卜素和叶绿素a、b合成基因的表达下调可能会进一步降低羊角月牙藻对CLA的抗性。
本研究中转录组和代谢组的检测与数据分析以及转录组、代谢组联合分析工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。
