2021-09-17
将单细胞和空间转录组学与数据集成算法相结合，研究鸡心从早期到晚期四腔心阶段的发育。对发育中的心脏、它们的空间组织以及它们在发育过程中的相互作用进行了多种细胞谱系的分析。心脏谱系分化转变的空间映射定义了心外膜谱系内上皮细胞和间充质细胞之间的转录差异。使用空间分辨表达分析，确定了解剖学上受限的表达过程，包括与先天性心脏病有关的基因的表达。最后，发现了在整个冠状血管发育过程中，分泌的小肽胸腺素 β-4 持续富集。总的来说，该研究确定了细胞分化和形态发生之间错综复杂的相互作用。
单细胞空间转录组研究背景
心脏是第一个发育的全功能器官，对胚胎发生至关重要。心脏发生涉及来自多个谱系的异质细胞群，这些细胞群在时空上相互作用以驱动心脏命运决定。鸡胚胎被用作心脏发生模型系统，因为鸡蛋中的子宫外发育允许特殊的早期心脏发生阶段，鸡心脏解剖结构类似于人类心脏解剖结构的许多方面。在四个关键心室发育阶段（HH21-HH24、HH30-HH31、HH35-HH36 和 HH40）生成了超过 22,000 个单细胞转录组。数据包括常见和罕见的细胞类型，包括来自多个谱系的祖细胞和成熟细胞类型。此外，在相同的四个阶段对总共 12 个心脏组织切片进行了空间分辨的 RNA-seq。
单细胞+空间转录组研究结果
1.心脏组织细胞类型鉴定
生成了 22,315 个细胞的单细胞转录组数据和 12 个组织切片的空间转录组数据，覆盖了 6800 多spots。在同一发育阶段收集的空间转录组和单细胞转录组强相关（Pearson相关；R >0.98）从心室中的心肌、心内膜和心外膜心脏谱系中鉴定出不同的细胞簇（图 1d）。除了心脏细胞类型外，还检测到少量红细胞、巨噬细胞和树突细胞。最后，确定了一种特殊的异质细胞群，它们表达高水平的胸腺素 β-4 ( TMSB4X )。
2. 时空谱系分析确定心脏祖细胞的异质性
使用了轨迹重建工具PHATE7和scRNA-seq 数据中的拟时序分析，将它们放置在与细胞分化相对应的轨迹上，通过估计局部 PHATE1 维度将有关从 scRNA-seq 的细胞转变的信息空间投影到空间图上。来自心室游离壁的 5,621 个心外膜细胞的聚类确定了五个主要细胞群：一个早期心外膜祖细胞群 (C1)、两个中间前体细胞群 (C2 和 C3)、一个成纤维细胞样细胞群 (C4) 和一个壁画细胞簇（C5）（图 2b，左图）。簇 C1 中的细胞主要来自 HH24（第 4 天）心室并表达典型的心外膜祖细胞标志物，例如转录因子 21 ( TCF21 ) 9、t-box 转录因子 18 10 ( TBX18 ) 和 Wilm 瘤 1 ( WT1 ) 11。还表示视黄酸的信令相关的转录物的醛脱氢酶12，13（ALDH1A2），参与心外膜发展公知的信号传导途径（图 2b中，左和右）。最后，这些细胞显示出中期因子 ( MDK )的富集表达，这是另一种视黄酸信号相关转录物和生长因子14，之前并未涉及心外膜发育。
3. 先天性心脏病 (CHD) 相关基因在空间上的表达
进一步探索空间 RNA-seq 数据集，以识别先天性心脏病 (CHD) 相关基因表达的时空模式。已发现超过 50 种人类基因的功能丧失显性突变与 CHD 相关，调控的水平可以预测有可能是冠心病的基因型和表现型之间的强相关性。对涉及 CHD 的基因进行空间 RNA-seq 分析，发现GATA5等关键转录因子的表达在瓣膜区域富集，IRX4 表达仅限于心室组织，TBX5在左心室富集（图 4a-b和图 3d）。PITX2基因是早期板中胚层侧向性的主要调节因子，是确定器官侧向性的关键成分，如预期的那样在心脏左侧富集（图 4c）。CHD 相关肌节蛋白编码基因如ACTC1和GJA5 的表达在心房和心室组织中均富集，但MYH7仅限于心房（图 4d-f）。
4. 冠状血管细胞中胸腺素β-4表达的富集
单细胞转录组的无监督聚类鉴定了富含TMSB4X的异质细胞簇，其中包含来自所有四个发育阶段的细胞，首先从该簇中重新聚类 1075 个TMSB4X高细胞并检查其细胞类型组成（图 5a）。发现簇1主要由表达TCF21的心外膜细胞和表达心内膜标志物IRX6 42和NPC2 43 的心内膜细胞组成（图 5a，右）。簇 2 主要由差异表达ACTA2的血管壁细胞组成（图 5a，右）。簇3主要由差异表达FABP5和TM4SF18的冠状血管内皮细胞组成（图 5a，右）。TMSB4X发现在空间 RNA-seq 数据的后期阶段富含瓣膜和心室壁。TMSB4X高细胞簇的差异基因表达分析确定了与细胞骨架组织相关的基因（波形蛋白（VIM）、Rho GTPase（RHOA）、肌动蛋白β（ACTB）、肌动蛋白γ1（ACTG1）和Destin 肌动蛋白解聚因子）的显着上调( DSTN ))（图 5b）。总之，结合空间分辨转录组学和成像数据表明，TMSB4X在所有细胞类型中普遍表达，但从冠状血管系统发育的开始到心室发育过程中冠状血管系统的成熟，在冠状血管细胞内富集。
单细胞+空间转录组总结讨论
单细胞和空间转录组学相结合，创建了发育中的鸡心细胞谱系的分层图。该数据集跨越四个发育阶段、22,315 个单细胞转录组和 12 个空间基因表达图，证明了细胞分化和形态变化是如何同时发生的。在过去的十年中，胸腺素 β-4 在心脏发育中的作用一直备受争议。胸腺素 beta-4 的心肌细胞特异性和内皮特异性 shRNA 敲低已被证明会导致心脏异常，但未发现整体、心肌细胞特异性和内皮特异性敲除的异常，深入了解β-胸腺素及其代偿机制如何影响心室发育过程中特定心肌细胞类型的生物学过程，有助于发现心肌梗死和先天性心脏病的治疗方法。
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