2022-02-22
《Veterinary Microbiology》
影响因子：3.293
近日，派森诺与广西大学合作，在兽医微生物领域的《Veterinary Microbiology》发表新研究成果！在本研究中分离并鉴定了一种新的多价噬菌体SaP7，其能感染多药的沙门氏菌S7和大肠杆菌；基因组测序、模型试验、药敏实验等一系列结果表明，该噬菌体与几种β-内酰胺类抗生素存在拮抗作用，故充分和谨慎地评估噬菌体/抗生素的相互作用和可能的结果是至关重要的。
研究背景
抗生素具有耐药性，特别是多药耐药性（MDR），是一个日益严峻的全球挑战。MDR细菌在人类和动物中经常被发现，对人类健康已经构成严重威胁。就沙门氏菌而言，自20世纪60年代初首次报道抗生素耐药性以来，全世界分离出对一种或多种抗生素耐药的沙门氏菌血清型的频率不断增加。事实上，沙门氏菌仍然是导致死亡的主要食源性细菌之一，因此迫切需要对耐多药沙门氏菌采取抗生素以外的治疗方法，其中噬菌体疗法被认为是治疗多药细菌感染的一种替代策略。然而，细菌往往容易对噬菌体产生耐药性，就像它们对抗生素产生耐药性一样，这极大地限制了噬菌体治疗的实际效果。其中，抗生素与噬菌体的组合不当的话会产生拮抗作用，进而降低治疗效果。然而，关于萘啶酸对噬菌体的拮抗作用的研究在很多年前就有报道，但是噬菌体与其他抗生素之间的拮抗作用则鲜有报道。本研究旨在体外检测SaP7噬菌体（分离和鉴定得到的多价噬菌体）与几种抗生素的相互作用，以及SaP7联合抗生素对仔猪和小鼠沙门氏菌感染的治疗作用。
研究材料与方法
2.实验材料：南宁某猪场污水中分离到噬菌体SaP7
3.测序平台： Illumina HiSeq
4.分析内容：噬菌体全基因组测序、毒力基因和抗生素抗性基因预测、共线性分析、系统发育树构建、药敏实验、噬菌体宿主范围鉴定实验、动物模型实验、组织病理学研究等等。
研究结果
从南宁某猪场污水中分离到噬菌体SaP7，该噬菌体在宿主中产生直径0.5-1mm的噬菌斑，该斑块边缘整齐、无晕环。电镜观察发现，该噬菌体是一个二十面体形状，具有立体对称的头部和一个长而收缩的尾巴。噬菌体衣壳直径118±2nm，尾长200±2nm。噬菌体SaP7根据系统(ICTV)属于Myoviridae家族。对沙门氏菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、奇异变形杆菌和铜绿假单胞菌等46株菌进行噬菌体SaP7感染活性检测，结果发现该噬菌体对4株沙门氏菌和35株大肠杆菌分别有1株和7株的空斑，结果表明噬菌体SaP7是一种多价噬菌体。
图1 噬菌体SaP7的形态和生物学特性
噬菌体SaP7基因组分析
SaP7的DNA双链基因组长度为240,613 bp, GC含量为48.41%。共预测得到254个ORF，其中63个ORF(24.8%)预测编码功能蛋白。与毒力相关的基因、毒素、抗生素抗性基因组在基因组中均未检测到，暗示SaP7被用于噬菌体疗法的安全性。主要衣壳蛋白序列的系统发育分析表明，噬菌体SaP7与沙门氏菌噬菌体SPN3US 、沙门氏菌噬菌体STsAS、沙门氏菌体SPAsTU 、变形杆菌噬菌体7 大肠杆菌噬菌体vB_EcoM_EC001和肠杆菌噬菌体SEGD1处于同一分支。结果表明，噬菌体SaP7可能属于 Caudovirales目、Myoviridae科、Seoulvirus属。
图2 SaP7噬菌体基因组圈图和噬菌体衣壳蛋白基因系统进化树
将噬菌体SaP7的基因组与其他感染 Caudovirales目特定宿主的噬菌体的基因组进行了比较，发现噬菌体SaP7与沙门氏菌噬菌体SPN3US (JN641803.1)的同源性最高(96.51%)；与Erwinia噬菌体Wellington，Erwinia噬菌体vB_EamM_EarlPhillipIV 和Cronobacter噬菌体CR5没有的同源性。这表明噬菌体SaP7是Seoulvirus病毒属的新成员。
图3：五种噬菌体全基因组共线性分析
噬菌体SaP7与β-内酰胺类抗生素联合治疗在体内对抗沙门氏菌S7感染的相互作用
为探讨噬菌体SaP7和抗生素联合使用的抑菌效果是否优于单一抗生素或噬菌体，分别用SaP7-AMC、SaP7和AMC治疗沙门氏菌S7菌株感染的仔猪。结果发现仔猪粪便内容物中SaP7和AMC处理组的细菌载量均明显低于未处理组，但令人意外的是，与SaP7和AMC单独处理组相比，SaP7-AMC处理组的治疗效果较差，原因是其细菌载量较高；与粪便细菌负荷一致，在脾脏、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠等不同组织中，联合处理组的细菌负荷均高于噬菌体或AMC单一处理组；对不同治疗组的脾脏进行组织病理学分析，以评估组织损伤的程度；与阴性对照组相比，其他四组均出现明显充血和病变。其中，无治疗组充血最明显，但SaP7-AMC组淋巴细胞数量明显减少，充血较SaP7单药组和AMC单药组更为明显。
图4：噬菌体SaP7与β-内酰胺类抗生素联合治疗仔猪沙门氏菌感染的疗效观察
为了进一步研究噬菌体SaP7与抗生素之间的拮抗作用，对s7感染小鼠进行了SaP7和AMX联合治疗。结果发现模拟感染组小鼠全部存活，而无治疗组的存活率仅为14.29%；AMX和噬菌体SaP7单独处理的小鼠存活率分别为71.43%和85.71%；SaP7-AMX联合治疗小鼠的存活率为42.86%，远低于SaP7或AMX单独治疗小鼠的存活率。存活小鼠在治疗后24h和7d也检测到脾脏的细菌负荷。SaP7和AMX单独处理组的细菌负荷均低于SaP7-AMX联合处理组，表明噬菌体SaP7在仔猪和小鼠体内对AMC和AMX均有拮抗作用。
图5 噬菌体SaP7与β-内酰胺类抗生素联合治疗BALB/c小鼠(AMX、阿莫西林)沙门氏菌感染的疗效观察
噬菌体SaP7与β-内酰胺类抗生素的体外相互作用
β-内酰胺类抗生素抑制噬菌体SaP7斑块的形成
为探讨sub-MIC-β-内酰胺类抗生素对噬菌体SaP7裂解活性的影响，采用单点试验检测了SaP7与阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸钾和头孢吡肟1/2MIC联合治疗时噬菌体斑块的形成情况。如图所示，在快速生长寄主的区域上，仅对噬菌体sap7进行处理，观察到4个清晰的斑块。而噬菌体SaP7与1/2MIC阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸钾和头孢吡肟同时处理含有目标菌株草坪的双层琼脂板时，却看不到斑块。结果表明，1/2MIC的阿莫西林或阿莫西林/克拉维酸钾均抑制了噬菌体SaP7的裂解活性。
图6 噬菌体SaP7与β-内酰胺类抗生素的体外相互作用
噬菌体SaP7降低了细菌对β-内酰胺类抗生素的敏感性
为评价噬菌体SaP7是否影响沙门氏菌S7对β内酰胺类抗生素的敏感性，分别检测了3种不同β-内酰胺类抗生素(阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸钾和头孢吡肟)与SaP7共作用时的MIC。MIC测定结果显示，与无噬菌体对照相比，在噬菌体SaP7存在时，阿莫西林和阿莫西林/克拉维酸钾的MIC分别提高了2倍和8倍。更具体地说，阿莫西林、阿莫西林/克拉维酸钾和头孢吡肟的MIC分别从512μg/mL、256μg/mL和16μg/mL增加到128μg/mL。结果表明，噬菌体SaP7可降低沙门氏菌S7对β-内酰胺类抗生素的敏感性。
拮抗作用不能阻止高滴度噬菌体或高浓度抗生素的抑菌作用
为研究噬菌体SaP7与β-内酰胺类抗生素联合应用是否能改变其抑菌效果，测定了不同MIC浓度的β-内酰胺类抗生素联合或不联合应用噬菌体SaP7时宿主菌S7在MH肉汤中的生长曲线。1/2MIC AMX和1/2MICAMC均负面改变了噬菌体SaP7裂解效果；噬菌体SaP7干扰1/2MIC AMC的抑菌细菌联用组的密度明显高于单用1/2 MIC AMC组；头孢吡肟几乎不能改变噬菌体SaP7的裂解效果；此外，噬菌体SaP7与3种抗生素之间的负相互作用似乎很弱；上述结果表明，噬菌体与3种抗生素之间存在拮抗作用，但不能阻止高滴度噬菌体或高浓度抗生素的抑菌作用。
图7 噬菌体SaP7与β-内酰胺类抗生素联合治疗对沙门菌S7生长的影响
噬菌体与抗生素之间的相互作用是复杂的，且不同于细菌和抗生素的种类。
由于SaP7是一种多价噬菌体，测试了噬菌体和抗生素联合使用对两种大肠杆菌宿主菌株(H6和E3)的抑菌效果。H6和E3在6h迅速对噬菌体SaP7产生抗性，11 h后不再降低细菌密度。首先，噬菌体SaP7 AMX和聚全氟乙丙烯对大肠杆菌的抑菌作用减少到H6,尽管这种影响没有在AMC中观察到；其次,一半剂量MIC聚全氟乙丙烯似乎很少影响到噬菌体2 - 9 H和稍微增加了抑菌大肠杆菌噬菌体的E3 12到16小时；而有趣的是，噬菌体SaP7严重影响抑菌1和2的MIC聚全氟乙丙烯，这是符合大肠杆菌代替的结果。第三,SaP7增加1/2MIC AMX的抑菌作用和1/2MIC AMC大肠杆菌E3与沙门氏菌S7相反，与大肠杆菌H6不同。
图8 噬菌体SaP7与β-内酰胺类抗生素联合治疗对大肠杆菌H6和e.c oli E3生长的影响
研究结论
1.Seoulvirus噬菌体SaP7是一种可以控制沙门氏菌和大肠杆菌的多价噬菌体；
2.噬菌体SaP7与3种β-内酰胺类抗生素联合治疗对肉汤中沙门氏菌的生长均有负干扰作用；
3.噬菌体SaP7与两种β-内酰胺类抗生素联用对感染沙门氏菌的仔猪和BALB/c小鼠均有拮抗作用；
综上所述，本研究提供了一种新型多价噬菌体SaP7与β-内酰胺类抗生素之间拮抗相互作用的证据，此发现可以用来告知临床医生在噬菌体和抗生素协同试验中可能出现的拮抗作用。
本研究的denovo测序和部分数据分析由上海派森诺生物科技有限公司完成。
