2022-04-11
《 Viruses-Basel》
影响因子：5.048
派森诺生物与广西大学动物科技学院合作，在病毒基因组领域《 Viruses-Basel》发表新研究成果！本研究从猪场污水中分离到一种多价广谱噬菌体，该噬菌体既能分解肠炎沙门氏菌，又能分解大肠杆菌，宿主范围广。通过对噬菌体的生长的条件和基因组测序发现，该菌具有较好的抗菌效果，且没有耐药和毒力相关基因。本研究结果表明，该噬菌体对控制沙门氏菌和大肠杆菌具有有效作用。
研究背景
细菌性食品污染是食源性疾病的主要原因，其中沙门氏菌和大肠杆菌是导致食品污染的常见细菌。沙门氏菌感染可引起多种症状，包括头痛、发烧、腹泻和腹痛；一些特定的大肠杆菌血清型具有致病性，可导致腹泻、水肿、出血性结肠炎、尿路感染和败血症等。物理、化学和生物等方法可用于控制食品中的细菌污染，然而，各种缺陷和不利影响给其应用带来了挑战。此外，在过去的几十年里，抗生素的过度使用导致了沙门氏菌和大肠杆菌在内的细菌的耐药性增加。因此迫切需要开发新的和有效的方法来控制食品中的沙门氏菌和大肠杆菌污染，以减少食源性疾病的发病率。
基于噬菌体的生物防治方法越来越被认为是减少食品细菌污染的前瞻性策略。与传统抗菌剂相比，噬菌体具有易于获得、特异性、对公众无害和环境友好等优点，许多实验研究报告了在各种食品中应用噬菌体来控制沙门氏菌和大肠杆菌污染。本研究分离并鉴定了一个名为EP01的多价广谱噬菌体，测定了该噬菌体的寄主范围、生物学特性以及在液体肉汤培养基(LB)中对寄主的溶解能力。本研究的主要目的是评估一种多价广谱噬菌体对两种不同食物中沙门氏菌和大肠杆菌污染的生物防治效果。
研究材料与方法
1.实验材料：
（1）使用了76株菌株，包括大肠杆菌、肠炎沙门氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等；
（2）从广西南京猪场污水中分离得到6株噬菌体。
2.测序平台：
Illumina NovaSeq
3.分析内容：
噬菌体基因组测序、毒力基因和耐药基因预测、系统发育树构建、（easyfig）比较基因组分析、噬菌体形态学鉴定、宿主范围鉴定分析等等。
研究结果
1.多价广谱噬菌体EP01鉴定
从污水中分离到6个噬菌体，分别命名为Tequatrovirus EP01、moigvirus EP02、moigvirus EP03、moigvirus EP04、moigvirus EP05和Felixounavirus EP06(命名为EP01、EP02、EP03、EP04、EP05和EP06)。这些噬菌体在双层琼脂平板上的形态干净明亮，边缘整齐，表现出典型的溶菌体特征。对噬菌体的宿主谱对76株菌株进行检验，发现在这些噬菌体中，EP01可以感染59株大肠杆菌中的31株和4株沙门氏菌中的1株(图1)。EP01对沙门氏菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和奇异变形杆菌等其他菌种的菌株上表现出较弱的溶解能力。EP01的斑块表型在不同的宿主上存在差异，如在大肠杆菌宿主菌株上，斑块清晰透明，直径不同。
图1 6株广谱噬菌体的宿主谱
2.生物学特性分析
平板上观察到的斑块形态显示EP01能够形成干净明亮的斑块，斑块直径为3mm。TEM显示EP01为二十面体形状，头部立体对称，尾部长而收缩；头部为典型的正多面体形状，直径为45.37 nm；尾长约150 nm，尾径约10 nm。根据国际病毒分类委员会(ICTV)的鉴定，EP01属Myoviridae科的T4-like病毒属。
将不同滴度的EP01与宿主菌混合培养4 h，结果显示，在MOI为0.001时噬菌体滴度最高，其次为1，说明EP01的最优MOI为0.001。一步生长曲线显示EP01的潜伏期约为20min；噬菌体滴度在50 min内急剧上升，EP01在随后的120 min内稳定生长，计算其爆裂大小约为216 PFU/CFU。pH稳定性测试中，EP01在pH值4 ~ 10范围内相对稳定，在强酸或强碱(pH < 4或pH < > 10)条件下，噬菌体滴度显著下降；此外，当pH值为3或12时，EP01无活性。在热稳定性测试中，EP01表现出较高的热容差。
图 2. 噬菌体 Tequatrovirus EP01 的生物学特性
3.噬菌体 Tequatrovirus EP01 基因组分析
高通量测序发现，EP01基因组长度为165,577 bp，GC含量为35.43%，基因组中未发现与抗生素耐药性、毒素和毒力因子相关的基因。EP01基因组共预测出257个CDSs，其中118个CDSs(45.91%)被预测为功能蛋白编码。在118个功能基因中，55个基因负责DNA复制和修复；45个基因参与结构和包装；8个基因与宿主裂解相关；6个基因参与转录调控基因。
图3. 噬菌体EP01基因组圈图
基于主要衣壳蛋白序列的系统发育树分析表明，EP01与肠杆菌噬菌体RB27、RB51和埃希菌噬菌体ECML-134处于同一分支，表示它们属于Myoviridae, Tequatrovirus属。EP01 和克雷伯氏菌噬菌体JIPh_Kp122(角病毒)之间共有142个保守蛋白同源(同源性>64%)。EP01与肠杆菌噬菌体RB27 (Tequatrovirus)之间有247个保守蛋白具有广泛的同源性(同源性>64%)，包括DNA引物酶、尾纤维和衣壳蛋白。
图4 主要衣壳蛋白序列系统发育树图
图5 不同噬菌体基因组比较图
4.噬菌体Tequatrovirus EP01对大肠杆菌的生长有抑制作用
实验结果显示，EP01能持续抑制所有被测沙门氏菌和大肠杆菌菌株的生长。阳性对照组，所有宿主菌株明显增加的数量从1 h - 5 h。EP01治疗后，在2h后可计数的肠炎沙门氏菌略升高，然后在3-5h的时候相对于对照组明显降低。在大肠杆菌中也发现了类似的结果，结果表明，在MOI为0.001时，所有检测的大肠杆菌在噬菌体处理后1 h内均呈缓慢增长趋势，2 ~ 5 h内达到稳定水平；MOI为1时，大肠杆菌O157:H7、O114:K90 (B90)和O142:K86 (B)的活菌数在1 h内略有增加，2 ~ 5 h后显著降低到初始水平。总的来说，EP01的抑菌效果和MOI浓度有关，MOI为1时的抑菌效果优于MOI为0.001时的抑菌效果。
图6. 噬菌体Tequatrovirus EP01在LB肉汤培养基中对4株致病性分离株的抑制作用
5.噬菌体Tequatrovirus EP01在防治肠炎链球菌、大肠杆菌（O157:H7、O114:K90 (B90)、O142:K86 (B)）中的应用
研究结果显示，抗菌效果与温度密切相关。在4℃和28℃条件下发现，EP01显著降低了肉和牛奶中肠炎链球菌、大肠杆菌O157：H7和大肠杆菌O142：K86在培养4、6、24 h后的活菌数。在受污染的肉和牛奶中，EP01可使大肠杆菌O114：K90的活菌数降至初始水平：在肉类中，在MOIs为0.001和1时添加EP01，4℃和28℃培养6h和24h后活菌数显著降低；4℃培养环境中，在牛奶中，在MOI为0.001时，EP01处理在培养6h和24h后其活菌数显著降低；在MOI为1时，培养4、6、24h后其活菌数也显著减少；在28℃培养环境中，MOI为0.001和1时添加EP01，培养4、6、24h后，观察到的活菌数显著降低。
图7. 噬菌体Tequatrovirus EP01对不同食品中细菌活性的抑菌作用
结论
1.从猪场污水中分离得到一株多价广谱噬菌体EP01，该噬菌体既能分解肠炎沙门氏菌，又能分解大肠杆菌，宿主范围广；
2.生物学特性实验表面，EP01在不同温度和pH水平下相对稳定，无耐药基因和毒力基因，比较安全；
3.电镜观察和基因组序列分析发现该噬菌体属于Myoviridae家族下的T4-like属，且该噬菌体基因组中无耐药基因和毒力基因，比较安全；
4.EP01还能抑制沙门氏菌和大肠杆菌在LB肉汤、肉和牛奶中的生长；
本实验表明，多价广谱噬菌体具有控制食源性病原菌的潜力，可作为食品工业中天然的生物防治替代物。
文章索引：
Zhou, Y.; Li, L.; Han, K.; Wang, L.; Cao, Y.; Ma, D.; Wang, X. A Polyvalent Broad-Spectrum Escherichia Phage Tequatrovirus EP01 Capable of Controlling Salmonella and Escherichia coli Contamination in Foods. Viruses 2022, 14, 286. https://doi.org/10.3390/v14020286
