2022-04-26
期刊：《mSystems》
影响因子：6.496
文章题目：Cultivating Lentinula edodes on Substrate Containing Composted Sawdust Affects the Expression of Carbohydrate and Aromatic Amino Acid Metabolism-Related Genes
发表期刊：mSystems
技术手段：RNA-Seq、标记定量蛋白质组学
派森诺与四川农业大学携手合作，于近期在《mSystems》上发表关于转录组和蛋白质组的联合分析，研究了堆肥木屑基质对香菇品质的相关基因表达的影响。
研究背景
香菇(Lentinula edodes)具有很高的营养价值和经济价值，其产量占世界蘑菇产量的五分之一以上。香菇的生长过程是从菌丝结生长到菌丝形成棕色膜、原基和子实体发育。其中，棕褐色菌膜的形成，是香菇生长周期中一个独特的阶段。褐膜的厚度和深度影响着原基的发育和子实体的品质，因此，褐膜的质量决定着香菇能否成功栽培。在香菇的大规模栽培中，木屑仍然是应用比较广泛的基质。
相关研究表明，适当调整培养基质有利于提高食用菌的潜在营养价值，采用堆肥栽培基质，可减少病原菌数量和杂菌污染。此外，由于木质素、纤维素等有机物的降解，菌丝更容易从堆肥基质中吸收营养物质。然而，堆肥基质在香菇栽培中并不常用，堆肥底物对栽培香菇的其他影响及其分子机制尚未得到系统研究。因此，作者对新鲜和堆肥木屑栽培的香菇进行了研究，重点研究了褐膜形成阶段，利用多组学技术分析了RNA和蛋白质水平上酶活性和基因表达的差异。
技术路线
研究结果
1. 堆肥改变了木屑的质量
堆肥使木屑的颜色由棕红色变为深棕色。木屑堆肥后，纤维素、木质素、半纤维素和有机碳含量显著降低，总含氮量显著升高(表1)。香菇菌丝在堆肥木屑上的生长速率更快，堆肥木屑（ND）的多糖含量比新鲜木屑（CK）更高(表1)。此外，ND组的褐膜形成较CK组提前了14天，以上说明木屑堆肥促进了香菇的生长。
表1堆肥木屑（ND）和新鲜木屑（CK）的理化特性
2. 转录组数据分析
经过Q20筛选后，每个样品通过质量过滤的clean reads约为43,000,000 ~ 49,000,000，占香菇褐膜cDNA文库中原始reads的94%。70%到79%的通过质量筛选后的reads比对到香菇基因组，其中约84%比对成功，超过96%比对到外显子。基于FPKM, CK和ND的基因表达水平相似(图1A)，说明数据可以进行后续的差异表达分析。
在注释到的9455个基因中，编码假定蛋白、MFS超家族转运蛋白、细胞色素P450、α/β水解酶、类受体激酶等基因的表达水平比较高。ND与CK相比，有235个差异表达基因(DEGs)，其中96个基因上调，139个基因下调(图1B)。上调的DEGs包括编码MFS超家族转运蛋白、细胞色素P450和丝氨酸蛋白酶抑制剂等基因；下调的DEGs包括编码胚胎发育晚期丰富(LEA)结构域的蛋白、醛酮还原酶和α/β水解酶的基因。
差异表达基因的功能富集分析中，DEGs富集到441个GO条目。在生物过程类别中，芳香氨基酸家族代谢、生物合成过程和分支酸显著富集 (图1C)。在分子功能类别中，富集到内肽酶及肽酶抑制剂、调节酶活性、以及碳氧裂解酶活性等。在细胞成分类别中，一共有61个DEGs被划分为四种膜成分GO条目中。在KEGG富集分析中，DEGs在苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸生物合成途径等28条代谢通路中显著富集。
图1 转录组数据分析
3. 差异表达基因的qPCR验证
通过qPCR检测18个DEGs的表达水平，9个基因通过RNAseq和qPCR分析的差异丰度标准(表2)，其中细胞膜组分条目的 8个DEGs中有4个，芳香氨基酸家族代谢过程条目中的4个DEGs中有2个，剩下的3个基因都属于碳水化合物代谢过程条目。
表2 qPCR验证结果
4. 蛋白组学数据分析
在TMT标记的多肽定量蛋白质组学分析中，在“shiitake”数据库中鉴定出2509个蛋白和8407个多肽。与CK相比，ND的187个差异表达蛋白中有74个上调，113个下调(图2)。在GO分析中，差异表达蛋白(DEPs)主要富集到代谢过程、单组分过程、细胞和细胞部分、催化活性和结合(图3)。
图2 在含有堆肥木屑(ND)和新鲜木屑(CK)的基质上培养的香菇棕膜的差异表达蛋白
图3差异表达蛋白的GO富集分析
在KEGG富集分析中，DEPs被分配到74个通路中。蛋白质：XP-007327210.1, XP-007325842.1, XP-007325855.1, XP-007328515.1, XP-007326488.1, XP-007326180.1, XP-007334384.1, XP-0073315491, XP-007332048.1, XP-007325723.1, XP-007325639.1, XP-007325271.1, XP-007326547.1, XP- 007333581.1的连接度最高，是蛋白互作网络图中的关键蛋白。在这些关键蛋白中，除了XP-007325271.1是酰基载体蛋白/NADP泛素氧化还原酶(ACP)外，其余均为假定蛋白。蛋白质XP-007326180.1、XP-007334384.1、XP-007331549.1、XP-007332048.1和XP-007325639.1都直接相互作用(图4)。
图4 蛋白互作网络分析
5. 碳水化合物活性酶分析
在转录组测序结果中，注释为碳水化合物活性酶(CAZymes)的基因占差异表达基因的7.2%。包括1个碳水化合物酯酶(CE)、1个糖基转移酶(GT)和4个辅助酶(AA)的基因表达上调；5个糖苷水解酶(GH)、3个CE、1个碳水化合物结合模块(CBM)、1个GT和1个AA基因表达下调(表3)。注释为CAZymes的蛋白占差异表达蛋白的15.5%。包括3个GH蛋白和1个AA蛋白上调；14个GH蛋白、4个CE蛋白、6个AA蛋白和1个多糖裂解酶(PL)蛋白下调(表3)。
表3 转录组中注释为CAZymes的差异表达基因和蛋白
6. 转录组和蛋白组的相关性分析
转录组与蛋白质组的Pearson相关系数为0.072。将蛋白质组和转录组富集的结果进行比对，发现两个组的前20条KEGG通路中有7条通路是共有的，分别是氰基氨基酸代谢、磷酸肌醇代谢、戊糖和葡萄糖酸盐相互转化、磷脂酰肌醇信号系统、RNA聚合酶、淀粉和蔗糖代谢和酪氨酸代谢途径(图5)。在蛋白质组和转录组中均检测到3对差异表达的蛋白和基因。其中，LENED_010224及其对应的蛋白A0A1Q3ELU5、LENED_004417 及其对应的蛋白A0A1Q3E6U4均上调，LENED_009984 (A0A1Q3ELG3)在蛋白组中上调，在转录组中下调。在GO分析中，A0A1Q3ELU5和A0A1Q3E6U4被划分为内肽酶抑制剂活性和氧化还原酶活性条目。KEGG富集分析得到酪氨酸代谢、脂肪酸降解和糖酵解/糖异生3条显著性高的通路。
图5 DEGs和DEPs的KEGG分析
7. 酶活性测定
为分析木屑堆肥对木质纤维素降解的影响，测定了香菇棕褐色菌膜木质纤维素降解相关酶活性。结果显示：果胶裂解酶的活性范围从5至10 U mL-1，β-葡聚糖酶的活性从10至20 U mL-1，纤维素酶的活性从16至25 U mL-1，锰过氧化物酶、漆酶和木质素过氧化物酶的活性均低于7 U mL-1(图6)。CK和ND的酶活性没有统计学差异。
图6 CK和ND的酶活性测定
文章小结
本文采用转录组学和蛋白质组学方法研究了在新鲜(CK)和堆肥(ND)木屑基质上培养的香菇，重点研究了其棕膜形成阶段。在以堆肥木屑为生长基质的培养基上，褐膜形成时间较短，菌丝生长速度较快，说明使用堆肥基质可以缩短香菇的培养时间。ND的生长速度快于CK，可能与ND含氮量高有关。在含木屑的堆肥基质上生长的香菇中，大部分注释于碳水化合物活性酶的差异表达基因被下调，可能与木屑中半纤维素和纤维素含量较低有关。与CK相比，编码MFS和细胞色素P450的基因在ND中表达上调，表明在这个阶段转运的物质更多。KEGG通路的变化可能与基质中纤维素、半纤维素和氮含量的差异以及在堆肥基质上生长的香菇较高的生长速率和多糖含量有关。
本研究中转录组和蛋白组的检测与数据分析工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。
