2022-05-10
《Advanced Science》
影响因子：16.807
题目：Metastable Iron Sulfides Gram-Dependently Counteract Resistant Gardnerella Vaginalis for Bacterial Vaginosis Treatment
技术手段：转录组，能量代谢
派森诺与无锡市锡山人民医院携手合作，于近期在《Advanced Science》上发表了题为Metastable Iron Sulfides Gram-Dependently Counteract Resistant Gardnerella Vaginalis for Bacterial Vaginosis Treatment的文章，该研究发现亚稳态硫化铁选择性杀菌机制，有可能为细菌性阴道炎中的耐药难题提供有效的解决方案。
研究路线
细菌性阴道炎(Bacterial vaginosis, BV)是世界上比较常见的女性阴道感染疾病，发病率高达29%，防治该病的费用全球每年约50亿美元。其发病机制是阴道菌群失调，乳酸杆菌减少而导致其他病原体如加德纳菌(G. vaginalis)等的大量繁殖。临床常用治疗药物是口服或局部使用抗生素如甲硝唑，但是超过半数的患者都会在一年内再次复发。其中主要原因是加德纳菌极易对甲硝唑产生耐药，形成生物膜（Biofilm）或侵入阴道上皮细胞中形成胞内菌（Intracellular bacteria），这些特征导致BV患者在抗生素治疗后容易复发。为了解决上述问题，急需开发不同于传统抗生素作用机制的抗菌药物。
纳米技术的发展提供了许多具有非抗生素机制的先进纳米材料和治疗策略来抑制抗菌素耐药性。最近研究发现，纳米硫化铁(nFeS)通过持续释放亚铁和多硫化物表现出强大的杀菌活性。nFeS不仅对革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌具有杀伤作用，而且还可清除生物膜和胞内菌。
本文对Fe3S4、Fe7S8、FeS2和FeS等不同物相的纳米硫化铁在富营养（培养基）环境下的抗菌性能进行了系统筛选。结果表明，亚稳态硫化铁对加德纳菌具有较好的抑菌活性，尤其是Fe3S4，主要表现为抑制糖酵解和诱导铁死亡损伤。这种协同作用机制确保Fe3S4可以对抗加德纳菌的耐药性，且治疗效果优于甲硝唑。
研究结果
1.亚稳态硫化铁抗菌活性检测
为评估硫化铁在培养环境下的抗菌性能，本文选择了四种不同物相的硫化铁：D-Fe3S4、z-Fe7S8、s-FeS2和s-FeS进行筛选，发现亚稳态硫化铁如Fe3S4、Fe7S8，特别是Fe3S4能够强烈抑制加德纳菌和部分抑制大肠杆菌的生长，而对革兰氏阳性菌（如金黄色葡萄球菌、乳酸杆菌）无抑制作用。相比之下，FeS和FeS2无抗菌作用(图1C-F)。这些结果表明并非所有硫化铁都能抗菌，其中Fe3S4、Fe7S8具有较好的抑菌能力；且对革兰氏阴性菌具有抗菌选择性，尤其是对加德纳菌的最小抑菌浓度（MIC）为7.8 ug/mL，其抗菌效果优于甲硝唑（图2）。因此作者选择D-Fe3S4进行后续实验。
图1亚稳态硫化铁的抗菌活性
图2 多硫化物的的抗菌选择性
2.多硫化物抑制糖酵解并与亚铁协同作用
为验证D-Fe3S4对加德纳菌的选择性抗菌作用，作者对D-Fe3S4处理过的加德纳菌进行代谢组和转录组分析。代谢组结果显示，D-Fe3S4处理确实对加德纳菌的糖酵解产生抑制。与未处理的加德纳菌相比，磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的含量上调了5.7倍，而葡萄糖6-磷酸和果糖6-磷酸分别下调了0.4倍和0.68倍(图3B)。转录组结果表明，D-Fe3S4处理后淀粉、蔗糖、糖酵解/糖异生通路下调，PTS糖转运亚基 (EIIC) 的转录增加，这进一步证实了D-Fe3S4对加德纳菌能量代谢的影响。
机制研究表明，上述硫化铁的抗菌效应与其释放多硫化亚铁的能力密切相关。亚稳态硫化铁Fe3S4、Fe7S8的铁硫键容易断开，遇水能够快速释放多硫化物（S22-、S32-）和亚铁。一方面，多硫化物能够快速进入菌壁较薄的加德纳菌内部，对糖酵解（Glycolysis）代谢通路中的关键酶-葡萄糖激酶(Glucokinase, GLK)产生抑制作用。蛋白结构预测表明，加德纳菌的GLK三维结构包含一个典型的口袋状活性中心，其边缘含有半胱氨酸残基（Cys179, Cys181, Cys186）。作者推测多硫化物通过跟这些残基发生多硫化反应，改变活性中心结构导致底物无法结合，从而阻断糖酵解通路。另一方面，释放的亚铁引起细菌铁死（Ferrroptosis-like death of bacteria），与多硫介导的能量代谢阻断效应协同杀死加德纳菌(图4)。
上述双重抗菌机制针对的是细菌的代谢抑制和氧化损伤，因此不易产生新的耐药性。
图3 多硫化物抑制能量代谢
图4 亚铁诱导铁死亡损伤协同抗菌活性
3.亚稳态硫化铁抑制加德纳菌的耐药性
加德纳菌的特点是对抗生素产生耐药性，最终导致细菌性阴道炎复发。作者通过构建菌株耐药模型，进一步评估D-Fe3S4是否适合用于临床治疗。结果如图5所示，Fe3S4对加德纳菌的甲硝唑耐药株（MRGV）、持留菌、生物膜和胞内菌珠均有非常强的抑制效果，且不易产生新的耐药性。
图5 D-Fe3S4抑制加德纳菌的耐药性
4.D-Fe3S4对乳酸杆菌具有良好的生物相容性
阴道乳酸杆菌(LV)是一种革兰氏阳性益生菌，在生物膜条件下可与加德纳菌共生。为评估D-Fe3S4的生物相容性，作者检测了不同浓度的D-Fe3S4处理下阴道乳酸菌的生存能力。结果显示，LV的生长基本未受影响 (图6)。以上数据表明，D-Fe3S4具有良好的生物相容性。
图6 D-Fe3S4对乳酸菌具有良好的生物相容性
5.D-Fe3S4是治疗细菌性阴道炎的合适候选药物
作者进一步利用小鼠感染模型，评估了纳米Fe3S4悬液及其栓剂对小鼠细菌性阴道炎的防治效果。结果显示两种剂型均能显著降低小鼠阴道内加德纳菌的数量，而甲硝唑对耐药菌无效；生理条件下，阴道内存在一定数量的乳酸杆菌（革兰氏阳性菌）维持菌群平衡，作者通过体内外实验进一步证实Fe3S4与乳酸杆菌联合治疗效果更佳。此外，作者还对100例临床阴道炎患者分泌物中病原菌验证了Fe3S4的杀菌效果，结果显示Fe3S4能够100%清除其中的加德纳菌。这些结果表明亚稳态硫化铁将是一类有效防治细菌性阴道炎的非抗生素类药物 (图7) 。
图7 D-Fe3S4用于治疗细菌性阴道炎
总结
综上，mFeS不同于传统抗生素的作用机制可能为硫化铁抗菌药物的研究提供新的思路。关键的是，mFeS是一种很有前途的候选药物，具有良好的生物相容性，可以特异性杀死加德纳菌且不易产生新的耐药性。面对细菌耐药性的挑战，mFeS可能作为一种宝贵的非抗生素药物替代品用于治疗频繁复发的BV，并提升女性的健康水平和生活质量。
