2022-06-06
《BMC PLANT BIOLOGY》
影响因子：4.215
近日，派森诺生物与四川大学合作，在植物生物学领域的《BMC PLANT BIOLOGY》发表新研究成果！在本研究中，对分离得到的7个前胡属的叶绿体基因组进行denovo测序和比较基因组学分析，结果发现该属的叶绿体基因组既具有保持性，又具有多样性，该研究为前胡属物种的肢体基因组进化、分类学和系统发育提供了新的视角。
研究背景
前胡属(Peucedanum)是伞形科(Apiaceae)的较大的属之一，其拥有许多经济和医学上的重要植物。前胡属是一种异质性极强的物种，在生命形式、叶片和果实结构、化学成分等方面表现出极大的多样性。因此，一些研究人员倾向于把这个属分成更小的、可能的分类单元。然而，由于叶片分裂、小苞片和分果的形态特征不同，很难从前胡属中再分离出一个属。因此，基于形态学特征去分类该属面临着挑战。
叶绿体基因组是植物三个DNA基因组（包括细胞核基因组和线粒体基因组）之一，该基因组在开花植物中是单亲本遗传的，缺乏重组，具有告诉可变的形状，因此，它有可能显著提高系统发育的支持度和分辨率。此外，叶绿体基因组的基因学分析和比较基因组学分析可以揭示叶绿体在结构组织、基因排列和内容上的多样性，从而加上对植物谱系适应进化的认识，并确定适合物种鉴定的突变热点。近年来，随着高通量测序和生物信息学技术的发展，叶绿体基被广泛成功地用于植物系统发育分析和特异性DNA条形码的开发。
在本研究中，对7个前胡属的叶绿体进行了测序，结合之前报道的5个叶绿体，对这一分类困难的植物类群的叶绿体进行了全面的分析。本研究的目的是：(1)研究前胡属植物的叶绿体体特征；(2)从叶绿体中筛选出合适的突变热点区域作为候选DNA条形码，用于前胡属植物的物种鉴定；(3)检测叶绿体对复杂前胡属植物系统发育支持度和分辨率的影响。本研究结果将为白皮属植物的系统发育和分类学研究奠定基础。
研究材料与方法
1.实验材料：
温室和野外中采集到的7个前胡属叶片，提取叶片total DNA后进行叶绿体基因组测序。
2.测序平台：
Illumina Novaseq
3.分析内容：
叶绿体基因组denovo组装注释、RNA编辑位点分析、核苷酸多样性分析、Mauve分析、RSCU分析、SSRs分析、IR区收缩与扩扩张分析和全基因组进化树构建。
研究结果
前胡属叶绿体基因组特征
表1 前胡属叶绿体基因组特征
对7个前胡属基叶绿体基因组进行二代Illumina测序，测序产生了36,875,778-44,140,972条高质量reads，其中有712,889-6,125,929条reads用于后续的基因组组装。叶绿体基因组大小范围为142,494-156,899bp，基因组测序深度范围为730.073X-6266.178X。它们都表现出典型的四分体结构，包括一对反向重复区域（IRs）、一个较大的单拷贝区域（LSC）和一个小的单拷贝区域（SSC）。12个叶绿体（7个本次测序+5个已发表的叶绿体基因组）基因组的GC含量介于37.4%-37.7%；12个叶绿体基因组编码了113-114个特有基因，包括79-80个蛋白编码基因，29-30个tRNA和4个rRNA基因。
图1 7个前胡属植物叶绿体基因组圈图
为了分析叶绿体的密码子使用情况，从每个叶绿体基因中提取了79个蛋白质编码基因并进行连接。这些序列长度为66552 ~ 68130 bp，编码22184 ~ 22710个密码子。在所有叶绿体中，Leu的密码子数量最多(2347 - 2404)，而Cys的密码子数量最少(234-243)。此外，12个叶绿体中所有密码子的相对同义密码子使用率在0.32 ~ 2.01之间。其中，30个密码子的RSCU值均大于1.00，而RSCU > 1.00的密码子AUA仅在P.insolens叶绿体基因组中。除UUG外，所有RSCU为> 1.00的密码子均以A/U终止。
图2 12个前胡属叶绿体基因组的RSCU分析
本次分析检测到12个叶绿体中35个蛋白质编码基因中存在56-60个潜在的RNA编辑位点。所有检测到的RNA编辑位点均为胞嘧啶到尿嘧啶(C-U)的转换，且大部分发生在密码子的第二位置(42-45)，其次是第一个密码子位置(12-16)，但没有发生在第三密码子位置。此外，ndhB基因包含的RNA编辑位点数量最多，从10个到11个。
对12个叶绿体基因组进行SSRs分析，检测到的SSRs总数为58 ~ 89个，大多数SSRs分布在所有叶绿体的LSC区域。在这些SSRs中，单核苷酸重复序列最多(28-54)，其次是双核苷酸重复序列(14-21)。此外，碱基A和T是12个叶绿体中所有SSR的主要成分。
图3 12个前胡属叶绿体基因组的SSRs分析
在12个Peucedanum叶绿体基因组中，IRa/SSC、IRb/SSC和IRb/LSC的边界稍保守:大部分样本IRa/SSC连接位于ycf1基因和ndhF基因之间，但在P . delavayi和P . angelicoides中扩展为ndhF基因；IRb/SSC的边界属于ycf1基因，大部分样本的IRb/LSC边界位于trnL和trnH基因之间。然而，前胡属叶绿体IRa/LSC的连接是不同的，可分为4种不同类型。IRa/LSC连接在P . delavayi和P . angelicoides，属于I型;在P . angelicoides中，IRa/LSC边缘收缩到trnL-trnH基因间区（II型）。而P . mashanense Shan et Sheh和P . medicum DunnP.mashanense Shan转移到rpl2-trnI的基因间区（三型）；其余品种大部分的IRa/LSC边界均属于ycf2基因，而P. chujaense K. Kim, S.H. Oh, C.S. Kim & C.W. Park和P. terebinthaceum (Fisch.) Fisch. ex T urcz.则收缩于ycf2- trnl基因间区。
图4 12个前胡属叶绿体基因组的IR区收缩与扩张分析
除了在P . japonicum Thunb.和 P . medicum发现trnY-trnD-trnE基因倒置外，12个前胡属叶绿体组的基因排列相对保守。然而，12份Peucedanum样品的整个叶绿体序列相似性较低，在142197个比对位点中识别出7350个变异位点。根据序列的差异，选择15个突变热点区域作为候选DNA条形码，包括Pi>0.01200的5个蛋白编码基因 ccsA, matK, rpl22, rps8, ycf1和Pi >0.03100的10个非编码区 ccsA-ndhD, ndhF-rpl32, petA-psbJ, psbA-trnK, rpl32-trnL, rps15-ycf1, rps2-rpoC2, trnH-psbA, trnK-rps16, ycf2-trnL。
图5 12个前胡属叶绿体基因组序列Mauve图
图6 12个前胡属叶绿体基因组序列Mivasta图
图7 12个前胡属叶绿体基因组核苷酸多样性(Pi)值的比较分析
图8显示了系统发育过程，包括两种支持值:BI后验概率(PP)和ML bootstrap值(BS)，这两个分析都有力地支持了Peucedanum的成员不是单系聚在一起，而是分为四个分支:(1)P. insolens归为弓翅芹属（Arcuatopterus）分支;(2)P . delavayi与Pterygopleurum neurophyllum的姐妹支，属于丝瓣芹属（Acronema）分支;(3) P.angelicoides与Semenovia transiliensis Regel & Herder聚集在环翅芹亚族（T ordyliinae分支）;(4)其余均属于亮蛇床族Selineae。大部分的Peucedanum物种属于Selineae，而这些样本也没有聚集在一个分支中。在赛林亚科中，鉴定出了三种主要的种系：（1）P . chujaense和P . terebinthaceum chujaense形成了一个与其他分支相对较远的分支；（2）P . mashanense 和P . medicum形成一个分支；（3）其余的Peucedanum物种形成一个分支。此外，本研究推断的非前胡属物种间的系统发育关系与前人研究基本一致，本研究结果为这些关系提供了较高的支持值（所有节点的PP = 1.00, BS≥96）。
图8 叶绿体基因组核进化树构建分析
研究结论
1. 本研究是首次利用叶绿体叶绿体数据全面研究白豆属植物叶绿体叶绿体特征并推断系统发育的尝试；
2. 比较分析发现，Peucedanum的叶绿体在基因组结构、密码子偏好性、RNA编辑位点和SSRs方面较为保守，但在基因组大小、基因含量和排列、SC/IR边界等方面存在差异；
3. 叶绿体系统发育分析结果表明，Peucedanum属不是一个单系群；
4. 叶绿体中发现了15个突变热点区域，这些热点区域可以作为潜在的DNA条形码用于物种鉴定；
5. 本研究为今后前胡属植物的系统发育和分类学研究奠定了基础。
本研究的denovo测序由上海派森诺生物科技有限公司完成。如需进一步讨论，欢迎发邮件或者致电我们哟（邮箱地址：microsupport@personalbio.cn，联系电话：025-58185663-836）！
文章索引：
Liu, CK., Lei, JQ., Jiang, QP. et al. The complete plastomes of seven Peucedanum plants: comparative and phylogenetic analyses for the Peucedanum genus. BMC Plant Biol 22, 101 (2022). https://doi.org/10.1186/s12870-022-03488-x
