2022-06-14
Environmental Science & Technology
影响因子：9.028
文章题目：Influence of Temperature on Biofilm Formation Mechanisms Using a Gravity-Driven Membrane (GDM) System: Insights from Microbial Community Structures and Metabolomics
技术手段：微生物组细菌16S rRNA基因、LC-MS非靶向代谢
派森诺与中国科学院生态环境研究中心携手合作，于近期在《Environmental Science & Technology》上发表关于水处理系统在低温下通量下降的内在生物学方向调控机制的相关研究成果。
研究背景
微生物普遍存在于环境当中，它们可以不断地改变自身的生存策略以适应环境的变化。然而，我们对于微生物知之甚少。生物膜的形成被认为是微生物生存和适应各种不利的内外环境因素的普遍现象。生物膜附着在物体表面并在其上发育，其结构涉及不同种类的微生物群落，包括藻类、真菌、细菌等。生物膜的主要成分是微生物的胞外聚合物（Extracellularpolymeric substances: EPS），EPS主要由微生物分泌而成，包含不同比例的蛋白、多糖和核酸。从医疗、饮食和水质的角度来看，生物膜的形成也对人类健康构成重大威胁。
在饮用水处理工艺的过程当中，去除生物膜被全世界公认为是一项关键的技术问题，特别是在饮用水的处理阶段和运输阶段的管道内壁上生成的生物膜。在水体净化的膜过滤工艺中，生物膜会在短时间内形成，所以对于生物膜的清除和控制尤为重要。低压重力驱动膜超滤技术（Ultrafiltration gravity-driven membrane: GDM-UF）是相对于传统膜过滤技术而出现的一种节能膜系统。并且，GDM系统能够确保生物膜的原始外观不被高压破坏。本研究以GDM-UF系统为研究模型，研究了两种不同水温条件下的生物膜结构特性及其形成机理。
技术路线
研究结果
1. 温度对通量和膜生物污染的影响
在4 °C（LT）和25 °C（HT）的两个温度条件下，GDM-UF系统连续运行21天，用以评估温度对通量和膜生物污染的影响。在前4天，观察到高温和低温GDM-UF系统通量都出现了显著下降，通量分别减少了约59.88%和78.82%(图1a)。之后，两种体系的通量下降速率都趋于稳定。累积通量结果显示，两种系统的纯水通量显著高于地表水累积通量(图1b)。对污染膜进行冲洗可降低水力阻力，并将水通量恢复到初始水平的70 75%(图1d)。通过计算得知，低温下的生物膜阻力系数Rb显著高于高温下的生物膜的阻力系数（图1c）。低温处理第14天和第21天多糖含量显著增加(图1e);然而，HT和LT系统的蛋白质浓度没有显著差异(图1d)。生物膜在低温下的总有机碳含量（TOC）显著高于高温系统(图1f)。
图1 通量、生物膜阻力和有机碳含量随时间的变化
2. 生物膜的表面形态
生物膜阻力的增加是导致通量下降的主要因素。通过扫描电镜对生物膜横截面形貌的观察可以发现，低温下的膜表面的生物淤积层的结构会更加致密，但在高温下极为多孔（图2）。我们发现高温下微生物的代谢速率是低温下的3倍(图4g,h)。高温条件下生物淤积层的结构含有明显的多孔结构，这为水分子的通过提供了方便的途径（图2d-f）。与SEM观察到的相似，AFM图像也证实了低温下生物膜的致密形成(图2g-l)。致密的生物淤积层实际上由沉积的有机物与少量的微生物在严格避光的条件下形成的(图1f)。有趣的是，从CLSM(图2p-r)和SEM(图S2)可以看出，高温下生物膜中仍然存在藻类。藻类个体叠加可能是造成高温下生物膜粗糙的原因。此外，CLSM图像也证实了低温下生物膜中多糖含量(红色标记)较高温下高(图2p-r)，说明这是生物膜抗性增加的主要原因之一。
图2 生物膜的形态特征 a-f为生物淤积层的横截面的SEM表征， g-l为AFM 对生物淤积层表面粗糙度的表征， m-r为生物淤积层蛋白、多糖和核酸的原位表征。
3. 生物膜成分分析
如图3所示，所有样品都明显含有相同的化学集团特征峰。图3中所显示出的大部分特征峰均为蛋白和多糖所含有的化学集团特征峰。其中1040 cm−1 (C=O)、1550 cm−1 (C-N 和 N-H)的特征峰分别代表蛋白质和多糖。而且，低温生物膜在1040 cm−1、1550 cm−1和1645 cm−1处的峰值高于高温生物膜(图3b)，并且随着低温时间的增加而增加。此外，FTIR结果还表明，在低温下生物膜中存在亲水官能团，特别是高极性官能团酰胺基（1641 cm-1）和羧基（1040 cm-1）(图3a,b)。较高的亲水性成分更有利于细菌聚集，从而在低温下形成致密的生物膜。通过光电子能谱检测结果（X-ray photoelectron spectroscopy，XPS）还分析了两种温度下膜表面的化学组成（图3c-h）。
图3 生物膜的功能基团组成 a-b分别为LT和HT的生物膜的傅里叶变换红外光谱图（FTIR）。4°c和25°c下生物膜的高分辨率X射线光电子能谱图（c,LT;f,HT）C 1s，（d,LT;g,HT）O 1s和（e,LT;h,HT）N 1s。
4.微生物多样性分析
两种温度下的GDM-UF系统的表面生物淤积层在第7天、第14天和第21天的样本的微生物群落结构能够保持高度的一致；但两种系统间的微生物多样性存在着显著差异(图4f)。取样原水（QH）和两个处理（LT 和 HT）中生物淤积层的细菌OTU数量分别为593、313和988（图4a）。显然，低温系统限制了微生的多种群发展，同时低温也降低了微生物的丰富度和均匀度（图4b-e）。丰度聚类分析结果（图4f）表明：微生物在门和目的水平上分为两个群落部分。
在进一步的研究中，我们利用BIOLOG平板法测定两种温度下生物淤积层收集的微生物对6种碳源（单糖、氨基酸、酯、醇、胺和羧酸）的利用情况。研究结果表明：25 °C条件下微生物可利用的碳源和不同种类的碳源利用速率明显高于4 °C条件（图4g, h），由此证实低温条件会显著的抑制微生物的代谢活性。
图4 基于高通量测序技术的细菌多样性分析
5.代谢组学分析
本研究采用非靶向代谢物检测的方法鉴定了不同温度下GDM-UF膜表面的生物淤积层的微生物代谢物物的差异。LT和HT组间的差异代谢物分别属于脂类和类脂分子（11.25%）；有机酸及其衍生物（10.83%）；核苷、核苷酸和类似物（7.08%）；有机杂环化合物（6.67%）；有机氧化合物（3.33%）；苯类（2.5%），苯丙酸和聚酮（0.42%）和未定义（54.17%）（图5b）。LT条件下比HT条件下有17种代谢物显著下调，23种代谢物显著上调。LT相对于与HT下调物质总量要显著高于上调物质总量（图5c），其中脂类和类脂分子是最显著的下调物质（图5a）。基于KEGG通路的代谢产物分析表明LT和HT生物膜的丰度不同，上调和下调最显著的代谢途径分别为嘧啶代谢和亚油酸代谢（图5d）。
图5 生物淤积层的代谢组学差异分析
6.代谢通路分析
研究报道称，低温条件下溶解氧（DO）会显著提高生物膜的黏附能力。并且，高浓度DO会抑制亚油酸代谢。低温条件下水中的溶解氧浓度要显著的高于高温条件下的溶解氧浓度（图6）。本研究中基于微生物代谢物的差异分析表明：亚油酸代谢在低温下被明显受到抑制（图5d）。本研究同时发现，低温下亚油酸代谢中的卵磷脂、亚油酸等物质均显著下调，其下游代谢产物二十碳三烯酸（Epoxyeicosatrienoic acids,EETs）也受到抑制。低温高DO浓度不仅抑制EETs的积累和导致糖和以及蛋白的增多，还会导致醛基的积累，导致生物膜的黏度增加。
然而，代谢通路的改变的负面影响还不仅于此。以上代谢的变化导致了尿素循环中的L-精氨酸的前体物质咪唑丙烯酸（属于组氨酸代谢）、脱氧胞苷、尿嘧啶等物质的含量显著增加（图6）。进而，L-精氨酸的含量必然增加，其下游产物尿素也会随之增加，这显然会对人们的日常饮水安全造成了严重的健康威胁。
图6 显著变化代谢物的代谢通路图
7.微生物多样性和差异代谢物联合分析
不同代谢产物与微生物多样性的相关性表明，Dependentiae菌门主要与亚油酸代谢有关的代谢物质存在显著相关性（图7a）。而Spirochaetota菌门和Acidobacteriota菌门与嘧啶代谢产物有着显著相关性（图7a）。斯皮尔曼相关热图分析表明：Deinococcus、Diaphorobacter、Emticicia等与上调的关键代谢物呈正相关（图7b）；Hyphomonas、Runella、TM7a、norank_f_A4b等与上调的关键代谢物呈负相关（图7b）。其中，Limnohabitans、Deinococcus、Diaphorobacter、Flavobacterium和Pseudomonas在低温条件下均为优势菌（图7c），它们促进了嘧啶代谢，抑制亚油酸代谢（图7b）。有趣的是上述优势菌均为兼性厌氧菌。
图7 差异代谢物与门分类级别细菌的代谢相关网络图
文章小结
本文通过GDM-UF模型实验探讨了低温下滤膜表面形成的生物污染层的机理，发现低温会增加水中的溶解氧含量。进而，在低温和高溶解氧的作用下使微生物的嘧啶代谢途径上调、亚油酸代谢途径的下调。同时，低温和高溶解氧会显著降低微生物的代谢速率和群落结构。确定了大部分能够在低温、高溶解氧的GDM-UF模型中生长的优势菌为兼性厌氧菌（Limnohabitans、Deinococcus、Diaphorobacter、Flavobacterium和Pseudomonas）。这些兼性厌氧菌在低温代谢过程中分泌了大量的胞外多糖，将自身包裹于其中，为自身创造了一个舒适的厌氧环境。但产生的胞外多糖却增加了生物淤积层的黏度，且多糖侧链中的C=O和O=C-O官能团也进一步提高了生物淤积层的黏度和其对水的阻力。
本研究中部分检测与数据分析工作由上海派森诺生物科技有限公司完成。
